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四环素表达调控系统

1992年Goseen等人成功的利用原核基因调控元件构建了四环素(tetracycline,Tet)真核细胞基因调控表达系统。目前,此系统已被广泛应用于基因功能和基因治疗领域的研究。

1.四环素调控表达系统的基本原理

Tet调控表达系统通过诱导药物(如四环素和强力霉素等)改变调控蛋白的构象,从而达到调控目标蛋白表达的目的。

Tet调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性操纵子为基础而建立的。Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein, TetR)与Tet操纵子(Tet operator, TetO)能够特异性结合。当无诱导药物存在时,TetR会与TetO结合,从而阻断下游耐药基因的表达;当有诱导药物存在时,TetR的构象会发生改变,并从TetO上脱离下来,使下游耐药基因得以表达,细菌从而获得耐药性。



2. Tet-on调控系统

利用TetR和TetO特异性结合的特点,多种类型的Tet调控系统逐渐发展起来。其中,应用较广泛的为Tet-on激活型系统。

Tet-on系统由调节表达载体和反应表达载体组成。调节表达载体包含一个人巨细胞病毒早期启动子(PhCMV)和反义Tet转录活化因子(reverse tetracycline transcriptional activator,rtTA)。其中rtTA由反义TetR(reverse TetR, rTetR)和单纯疱疹病毒(HSV)VP16 蛋白C端的一段转录激活区域融合而成。反应表达载体由Tet应答元件(Tet-responsive element, TRE)、CMV启动子(minimal CMV promoter, PminCMV)及目的基因组成。其中TRE是7个重复的TetO序列。

Tet-on原理:

rtTA是由tTA突变4个氨基酸形成,它的表型与tTA相反。生理条件下,rtTA与TRE不结合,由于PminCMV缺少增强子,因此目的基因不表达;给于DOX后,DOX与rtTA的结合体与TRE结合,从而启动基因表达。


Tet-off原理:

Tet转录活化因子(tetracycline transcriptional activator, tTA)是由TetR的1-207个氨基酸和单纯疱疹病毒VP16激活结构域的C端127个氨基酸组成。VP16的增加使得TetR由转录抑制因子变为转录激活因子。生理条件下,tTA主动与TRE结合,启动基因表达;若给于DOX后,DOX与tTA的结合体与TRE解离,从而抑制基因表达。


3. Tet-on调控系统的优势

Tet-on调控系统集高效率、精准、安全、可逆性四大特点。


4. 维真Tet-on/off服务项目

Tet-on表达调控系统是当前应用更为广泛的四环素调控系统,所以下面小V将以Tet-on为例对维真可做的服务项目进行简单介绍。

维真生物能为客户提供Tet-on表达调控载体,并能根据客户需要包装成teton的腺病毒、慢病毒和腺相关病毒。目前维真使用的是第三代技术(TRE3G)。第三代技术相比于前两代技术来说,背景更低,药物敏感度也更高。

病毒类型

表达载体 (点击查看载体详情)

慢病毒

pLent-TRE3G-ZsGreen-mir30-hPGK-rtTA-SV40-Puro
pLent-TRE3G-hPGK-rtTA-SV40-Puro
pLent-TRE3G-FH-CMV-copGFP-P2A-Puro

腺病毒

pADM-TRE3G-FH-hPGK-rtTA-mCMV-copGFP

AAV

pAV-TRE3G-FH-hPGK-rtTA
pAV-hPGK-rtTA-TRE3G-EGFP-mir30
pAV-TRE3G-P2A-EGFP-hPGK-rtTA


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