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分子克隆服务


为研究某一基因的生物学功能,通常需要先将所研究的基因克隆出来,这就需要用到分子克隆技术。目前,分子克隆已经成为分子生物学研究中的基础方法。维真生物凭借丰富的分子克隆经验以及专业的技术团队,为您提供高效快捷的分子克隆服务,帮您从繁琐的分子克隆实验中解脱出来,从而使您能够集中精力投入到创新性研究工作中。维真生物的分子克隆服务可以灵活地满足研究者不同科研项目的要求,主要包括如下几个方面:


服务编号

服务类型

规格

目录价

货期

WZ010001

载体构建

5ug质粒+500ul菌液

基因长度≤3kb, 模板费用+¥1,200.00;

基因长度>3kb,≤4kb,模板费用+¥2,400.00;

基因长度>4kb,询价

2-4周

WZ010002

载体改造

5ug质粒+500ul菌液

2-4周


*如您对上述服务感兴趣,请您点击欢迎垂询”留下您的信息,我们将为您提供具体实验方案和项目价格。


相关服务:定点突变 腺病毒包装 慢病毒包装 腺相关病毒包装服务 稳定细胞系建立



↓↓ 分以下几个部分做详细介绍 ↓↓

  • 服务简介
  • 服务特色
  • 服务流程
  • 相关资料
  • FAQs
  • 相关产品
  • 客户文章

分子克隆(molecular cloning)又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术。DNA重组技术是20世纪70年代初兴起的技术,目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来,在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达,产生影响受体细胞的新的遗传性状。而载体是一种运输工具,它将一个有用的目的DNA片段通过DNA重组技术,递送至受体细胞进行繁殖或表达。在基础研究中,常用的载体是质粒和病毒。


质粒

质粒(plasmid)是一种独立于染色体外的稳定的遗传因子,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中,大小从1-200kb不等。它主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中,具有自主复制和转录能力,但是需要依赖宿主细胞编码的酶和蛋白。它能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。

质粒按照功能可以分为克隆质粒和表达质粒。作为理想的克隆质粒,质粒需要具备以下条件:①一个复制起点ori(replication origin),这是质粒自我复制必不可少的基本条件;②一个或者多个选择性标记基因,如抗生素抗性基因;③多克隆位点:外源基因插入后不影响质粒的复制;④分子量小,易于操作,插入外源基因后仍可有效递送至受体细胞;⑤拷贝数多,方便外源基因在细胞内大量扩增;⑥具有较好的安全性,不能任意转移。下图是克隆质粒的图谱:





相对于克隆质粒,一个表达质粒所包含的元件要更复杂。下面是表达质粒的图谱和常见元件:



元件

描述

复制起始(ori)

有利于质粒自我繁殖。

抗生素抗性基因

为了方便筛选在细菌中扩增得到的质粒DNA,质粒中需要添加便于筛选的抗生素抗性基因。常使用的抗性基因包括:Ampicillin、Kanamycin、Hygromycin B、Spectinomycin、Tetracycline等等。

多克隆位点(MCS)

MCS是包含几个限制性酶切位点的DNA短片段,可以通过限制性酶进行酶切连接插入外源DNA。在表达质粒中,MCS通常位于启动子的下游,且限制性酶切位点是唯一的,不存在于质粒其他位置。

插入片段

插入片段是克隆到MCS中的基因,启动子或其他DNA片段。 插入片段通常是进行特定研究的遗传元件。

启动子

驱动插入DNA片段进行转录。启动子招募特定生物的相关转录机制。特定生物可以选择特定的启动子;另外,启动子还可以指导细胞特异性表达,通过组织特异性启动子来实现。启动子的强度对于插入DNA片段的表达水平也很重要(即强启动子能够使插入DNA片段高表达,而弱启动子则可以使插入DNA片段呈现内源性表达水平)。

选择性标记

选择标记通常以非细菌启动子控制的抗生素抗性基因或荧光蛋白的形式存在。作为选择性标记,在遗传选择和筛选检测方面都能够便于实验中的测定。

引物结合位点

此序列有利于检测插入基因的正确性和质粒上其他区域序列的正确性。



病毒:

对于转染困难的细胞,科研工作者通常会选择病毒来导入目的基因。目前,腺病毒、慢病毒和腺相关病毒是常用的病毒载体工具。那么如何选择适合您实验体系的病毒工具,请参考下面3种病毒工具的比较:


病毒表达系统

腺病毒

腺相关病毒

慢病毒

病毒基因组

dsDNA

ssDNA

ssRNA

病毒外壳

具有包膜蛋白

基因组大小

38-39kb

5kb

9kb

包装容量

7.5kb

4.5kb

6kb

感染的细胞类型

分裂细胞和非分裂细胞

分裂细胞和非分裂细胞

分裂细胞和非分裂细胞

整合至宿主基因组

非整合

非整合

整合

表达丰度

高水平表达

高水平表达

中到高水平表达

表达时间

快(1-2天)

1-2周(体内)

慢(2-4天)

外源基因持续表达时间

短暂

潜在的持久

长久

免疫反应

较高

极低

相对病毒滴度

10E10pfu/mL

10E13VG/mL

10E8TU/mL

生物安全等级

BSL-2

BSL-1

BSL-2



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质粒凭借操作简单、易于制备、性能稳定和用途广泛等特点已成为分子生物学的基本工具。因此,分子克隆技术已成为每个科研工作者必备的一项技能。它虽然简单,却很花时间。维真生物是您不二的选择,主要有以下几点特色:

1. 维真生物拥有2大人源基因质粒库,包括人源ORF cDNA克隆和人源microRNA克隆。基因模板可以直接用现成的,省去了获得模板的烦恼;
2. 维真生物的技术团队拥有丰富的克隆经验,只要您提出实验需求,我们就可出具相应的实验方案,将您的实验需求落地;
3. 无论您的目的是哪一种(蛋白编码基因、lncRNAsmicroRNAscircRNA和启动子等调控序列),维真生物均不在话下;
4. 维真生物提供质粒构建、病毒包装和基因表达分析等服务,满足您不同实验需求;

5.维真生物的四环素诱导系列载体和Cre on & Flp on系列载体满足您时空条件性控制目的基因表达的实验需求。

我们常说的分子克隆通常包括合成模板、酶切、连接、转化、挑菌和重组克隆验证步骤。下面以从AAV ORF质粒构建到病毒包装为例说明,服务流程示意图如下:



Step 1:选择合适的载体

选择载体的时候,通常要考虑诸多因素,比如细胞类型,基因大小,基因是否具有特殊性等。维真为您提供各种基因表达载体以及病毒载体,此外,您也可以自己提供载体。对于某些难感染的细胞,病毒载体的效率要远远优于质粒载体,而每种病毒穿梭系统都有其各自的特点。


Step 2:选择合适的启动子

载体的包装容量问题,是选择载体时的关键考虑因素。由于载体包装容量有限,因此要选择效果好且大小合适的启动子,下表列举一些维真现有的组织特异性启动子,如果您没找到想用的启动子,可以联系我们。


组织

启动子名称

启动子
大小

启动子
来源

启动子描述

启动子应用

神经

hSyn

471bp

人源

突触蛋白1启动子

神经元特异性启动子

CamKIIa

1.2kb

小鼠

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II α启动子

大脑新皮质和海马兴奋性神经元特异性启动子

c-fos

1.7kb

小鼠

c-fos基因启动子

兴奋性神经元启动子

Mecp2

230bp

小鼠

甲基 CpG 结合蛋白 2启动子

短的神经元特异性启动子

NSE

1.3kb

小鼠

烯醇化酶启动子

神经元特异性启动子

Somatostat(SST)

1.2kb

人源

生长抑制素I基因的启动子

gamma氨基丁酸能抑制性神经元SST亚型特异性启动子

TH

2.5kb

大鼠

酪氨酸羟化酶基因启动子

多巴胺能神经元特异性启动子

GFAP

2.0kb

人源

胶质纤维酸性蛋白启动子

星形胶质细胞特异性启动子

GFAP104

845bp

人源

EF1a和GFAP的嵌合型启动子

星形胶质细胞特异性启动子

GfaABC1D(truncated GFAP)

681bp

人源

胶质纤维酸性蛋白启动子

星形胶质细胞特异性启动子

ALDH1L1

1.3kb

人源

醛脱氢酶1家族成员L1启动子

丘脑中星形胶质细胞特异性启动子

MBP

1.3kb

人源

髓磷脂碱性蛋白启动子

少突胶质细胞特异性启动子

肝脏

ALB

2.4kb

小鼠

白蛋白启动子

肝脏特异性启动子

TBG

460bp

人源

甲状腺素结合球蛋白启动子

肝脏特异性启动子

ApoEHCR-hAAT

1.3kb

人源

载脂蛋白E的肝细胞控制区和人α1抗胰蛋白酶启动子的嵌合启动子

肝脏特异性启动子

心脏

aMHC

0.4kb

小鼠

肌球蛋白重链α启动子

心脏特异性启动子

cTNT+intron

0.7kb

心肌肌钙蛋白T启动子

心肌特异性启动子

眼睛

Rpe65

0.7kb

小鼠

视网膜色素上皮65启动子

视网膜色素上皮细胞特异性启动子

VMD2 promoter

0.65bp

人源

卵黄形成黄斑性营养不良2基因启动子

视网膜色素上皮细胞特异性启动子

胰腺

Insulin receptor

0.85kb

小鼠

胰岛素基因启动子

胰腺β细胞特异性启动子

PDX1

2.7kb

小鼠

胰十二指肠同源盒1启动子

胰腺β细胞特异性启动子

血管

SM22a

0.45kb

小鼠

SM22α启动子

血管平滑肌特异性启动子

ICAM2

0.15kb

人源

细胞间粘附分子2启动子

血管内皮特异性启动子

CD68

0.7kb

人源

CD68分子启动子

单核巨噬细胞特异性启动子

F4/80

1.2kb

小鼠

F4/80基因promoter

巨噬细胞特异性启动子

肌肉

MCK

1.3kb

小鼠

肌酸激酶基因启动子

肌肉细胞特异性启动子

3×enhancer McK

728bp

小鼠

修改的肌酸激酶基因启动子

肌肉细胞特异性启动子

肾脏

NPHS1

1.2kb

小鼠

Nephrin 1基因启动子

肾脏特异性启动子



Step 3:插入ORF片段

维真拥有超过维真拥有超过18000余个人源ORF的现货克隆库,可以通过简单的“剪切粘贴”穿梭到我们的病毒载体中。如果您想从我们的人源ORF库中选择,只需提供相应的产品编号、基因名称或基因编号。如果您想定制,我们还提供分子克隆定点突变服务。此外,您也可以提供自己的序列,我们将其克隆到相应的载体中。


Step 4:选择合适的标签

维真提供各种标签、报告基因和诱导系统,可用于在 AAV克隆、腺病毒克隆或慢病毒克隆期间自定义我们的病毒载体。


Step 5:病毒包装

如果您选择的是病毒载体,后续有病毒包装的需求,那么我们可以直接将构建好的自定义载体包装成病毒颗粒。请访问病毒包装页面,了解更多有关慢病毒、腺病毒和腺相关病毒包装的相关资料。



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1. 如果我不知道序列两端的酶切位点,也不知道载体的图谱,但可以提供基因序列和测序引物的序列,你们是否可以承接这个项目?

可以,但是我们在克隆之前需要测序验证酶切位点附近的序列。


2. 我们能够提供细菌培养物作为亚克隆的原材料吗?

不推荐,因为细菌培养物不如DNA稳定,但是如果细菌培养物是唯一的选择,我们也可以尝试去做。



3. 模板是维真生物之前合成的,你们依然有质粒备份吗,还是需要我们再次提供?

我们通常会保留质粒备份1年。如果先前的订单已完成1年多,但是不超过5年,我们可能还有备份,但是需要跟生产部门核实。


4. 我们有引物,需要我们提供还是你们自己设计并合成?

我们将自己设计并合成用于克隆的引物,您只需要提供我们模板,并让我们知道您最终想得到的基因序列。


5. 我有复杂的克隆方案,我需要设计克隆方案吗?

您只要提供给我们模板序列、模板载体和目的序列、目的载体,我们的生产小组将会设计最优的克隆方案。



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