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关于维真

基因敲除效果的检测

服务介绍

CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)以来的第3代基因编辑技术。该技术自2013年迎来了高速发展时代。它利用含有与靶基因同源的sgRNA与Cas9共同作用切割靶基因。在基因敲除实验中,由于gRNA所介导的基因敲除效率难以预料,因此,高效gRNA的选择对于成功敲除基因是非常关键的。为了提高切割效率,科研工作者通常会设计3-5条gRNA,并筛选高效gRNA。无论是特异gRNA敲除效果的检测,还是高效gRNA的筛选,科研工作者均需要通过生物实验手段来验证。维真生物可根据您的实验需求提供个性化的基因敲除效果检测服务。



服务内容

维真生物可采取多种方法帮客户检测特异gRNA敲除效果和筛选高效gRNA,具体信息详见下表:

服务编号

服务类型

规格

目录价

货期

WZ100001-1

特异gRNA沉默效果检测

荧光检测 推荐! 直接克隆测序

¥9600.00/次

1-2周

WZ100001-2

特异gRNA沉默效果检测

PCR产物测序

¥6000.00/次

1-2周

WZ100002-1

高效gRNA筛选

荧光检测 推荐! 直接克隆测序

¥9600.00/次

1-2周

WZ100002-2

高效gRNA筛选

PCR产物测序

¥6000.00/次

1-2周


*如您对上述服务感兴趣,请您点击欢迎垂询”留下您的信息,我们将为您提供具体实验方案和项目价格。


相关服务: CRISPR-Cas9克隆 腺病毒包装 慢病毒包装 腺相关病毒包装 KO细胞系建立




荧光法检测敲除效果特色!

敲除效果的常规检测方法是PCR产物测序的定性法和直接克隆测序的定量法。这两种方法受细胞类型的限制,它们是在基因组水平进行测量,故结果真实度比较高。尽管如此,它们在操作、实验周期和检测细胞类型方面就显得逊色。为了克服这些问题,维真生物建立了一套简捷和可重复的基因敲除效果检测系统——荧光法。



设计策略

维真生物CRISPR/Cas9荧光法检测敲除效果设计策略



优势

1. 操作简单;

2. 周期短,通常3个工作日即可完成;

3. 敲除效果检测不受细胞类型的限制;


4. 敲除效果直观、明了,通过EGFP是否发光检测敲除效果的发生;通过EGFP的发光强度定性敲除效率;

5. 实验结果可靠、重复性好。



下图是根据某基因设计多条gRNA序列,将pKO-Reporter和gRNA、Cas9质粒共转染HEK293,48h后观察的荧光结果:





PCR产物测序、直接克隆测序和荧光法的比较



检测方法

周期

定性/定量

真实度

细胞类型受限性

PCR产物测序

较短,4-5个工作日

定性,根据套峰情况判断敲除效果和效率

好,基因组位点切割

受限制

直接克隆测序

长,10-15个工作日

定量,可计算敲除效率

好,基因组位点切割

受限制

荧光法

短,3个工作日

定性,根据荧光情况判断敲除效果和效率

较好,切割位点在外源质粒

不受限制



服务流程




相关资料


维真生物质粒转染试剂说明书

质粒转染试剂说明书




TALEN

Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs) 转录激活样效应因子核酸酶是具有序列特异性的限制性内切酶,通过融合类转录激活因子效应物(TALE)的DNA结合结构域实现DNA双链的断裂,借助宿主细胞DNA修复机制,通过同源重组或非同源性末端连接 (NHEJ)进行DNA修复,从而产生Indel基因编辑效果。其作用原理见下图:





TALE(TAL effectors,类激活因子效应物):

TALE是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白,能够识别特异性DNA碱基对。



设计策略:


维真生物CRISPR/Cas9-TALE-设计策略



优势

1. 维真生物拥有一整套四聚体克隆,直接用来组装18碱基重复单元;

2. 可提供各种病毒载体;


3. 克隆全部经过全长序列测序;

4. 可提供敲除效果验证附加服务。




应用示例——腺相关病毒在人源基因组中整合位点AAVS1的基因编辑





TANLEN & CRISPR Cas9的区别


比较项

TALEN

CRISPR-CAS9

识别靶序列模式

Protein-DNA

RNA-DNA

匹配靶序列模块

一个RVD(重复可变双残基)识别单个碱基

RNA-DNA碱基互补配对

靶序列碱基数

>16bp *2

~20bp

脱靶率

有潜在脱靶性

多个基因同时敲除

不可以

可以

甲基化敏感

敏感

不敏感

适用物种

广泛

广泛


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