1. AAV 和重组rAAV的区别？

腺相关病毒（AAV）属于微小病毒科，是一类小的、二十面体、无包膜病毒。1965年，AAV发现于腺病毒制备物中，并由此得名。AAV是一种复制缺陷性病毒，其复制依赖于其他辅助病毒，如腺病毒和疱疹病毒。AAV不编码自己的聚合酶，因此其复制过程依赖于宿主细胞的聚合酶活性。

重组AAV（rAAV）是人工改造的AAV，没有编码AAV病毒复制和结构蛋白的rep和cap基因。rAAV中与复制和包装相关的rep和cap 基因被替换为ITRs间的基因表达框，这使rAAV具有约4.7 kb的包装容量。

2. 使用AAV有哪些生物安全性要求 ?

可在生物安全1级（BSL-1）实验室操作生产无辅助病毒和编码非致癌基因的重组AAV。另外，应在生物安全2级（BSL-2）实验室封闭处理具有生物危害性的材料。

3. 重组AAV 安全吗 ?

迄今为止，未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV，在无需辅助病毒（如腺病毒）的存在下，复制效率非常低。重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒）组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列，因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。

4. 重组AAVs的克隆容量有多大?

AAV具有〜4.7Kb的包装能力。2个ITR之间插入的DNA长度接近允许的最大值4.7Kb时，包装效率显著降低。例如，对于过表达来自cDNA的基因，CMV-poly（A）信号元件约为1KB，因此最大可包装的cDNA长度约为3.2kb，如果共表达GFP（约0.8kb），则可包装的容量大约为2.4kb。

5. 哪些血清型的AAV可供选择？

目前为您提供的AAV 血清型为AAV1，AAV2，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8 &，AAV9，AAV rh10，AAV retro，AAV ANC80，AAV DJ & AAV DJ-8，AAV PhpB & AAV PhpeB，AAV 7m8和AAV shh10等。

6. 使用重组腺相关病毒rAAV递送基因的优势是什么 ?

rAAV病毒滴度高，可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性小、体内表达外源基因时间长。

7. AAV载体稳定吗? 如何保存AAV载体 ?

纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后，-80℃下长期保存。

8. 订制AAV服务，客户需要提供哪些材料? 客户收到的产品是怎样的 ?

您可以从我们的人源ORF cDNA库中挑选，或者提供您的质粒DNA或DNA序列，我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。

基因沉默服务，请您提供已验证的shRNA序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。

通常情况下，可为客户提供500 ul病毒液1×10^13 VP/ml。也可根据客户的需要，提供特定规格的产品。

9. 慢病毒、腺病毒、腺相关病毒三种病毒有什么区别？如何选择？

对于转染困难的细胞，科研工作者通常会选择病毒来导入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相关病毒是常用的病毒载体工具。那么如何选择适合您实验体系的病毒工具，请参考下面3种病毒工具的比较：

1. 您好，我感染的细胞是滋养层细胞，感染之前在六孔板中接种十万细胞，贴壁16h后加加入病毒（MOI=40），30h后细胞长满。我想咨询：病毒感染后实验组跟对照组相比细胞生产差不多，正常吗？

如果感染腺病毒的细胞状态与未感染组的细胞状态无明显差异，说明该病毒对细胞没有明显毒性作用。因此，未必是病毒数量不够。非腺病毒包装细胞被腺病毒感染后是不会有什么明显的特征。如果您在加入病毒的时候是提前把病毒用培养基稀释混匀之后再加入培养皿中的，那么高MOI值（导致细胞飘起来）对于目的细胞是比较高的。因此，您不用担心，可以先检测一下是否有蛋白表达。

2. 腺病毒感染细胞后是否需要更换新鲜培养液？

是否需要更换新鲜培养液需要看加入病毒的量，病毒量多的时候会对细胞有毒性：如果镜检时看到细胞状态有变化，需要在4-8h左右更换新鲜培养液；如果镜检时看到细胞状态无明显变化，那么病毒感染细胞之后就无需更换新鲜培养液。或者，如果您担心病毒长时间作用于细胞会有毒性，也可在12h后更换新鲜培养液。

3. 腺病毒感染细胞4-6h之后发现细胞全部飘起来了，请问这是怎么回事？

造成上述现象的原因主要有三点：

1）细胞的状态：感染之前铺板的细胞一定要使用健康的细胞；

2）实验操作不当：在加入病毒液的时候，如果局部病毒浓度过高会导致细胞死亡。因此，我们建议将病毒和培养基混匀之后再加入细胞中。

3）如果以上2点均无误，那就是加入的病毒量太大了。

4. 腺病毒感染细胞时，加入病毒量的依据是什么？

要得到最佳实验结果，确定腺病毒的最适用量是关键。量不足达不到100%感染效率；量太高则会对细胞产生毒性。那么如何确定呢？"感染复数"(MOI，multiplicity of infection)起着决定作用。MOI是是感染时病毒与细胞数量的比值。不同细胞系细胞表面的腺病毒受体数量不同，这就决定了不同细胞系的MOI会有所不同。通常，易感染细胞系所使用的MOI范围为10-100。 但是，对于某些难感染的细胞系，MOI可能需要高达1000。对于大多数细胞系来说，最佳MOI的范围很窄。我们建议您查阅文献或者在正式实验前，在目的细胞中用报告基因的腺病毒进行预实验摸最佳MOI。

最适病毒用量的计算公式：
病毒用量pfu=最佳MOI×细胞数目/病毒滴度
例如, 如果您目的细胞的最佳MOI=10，您需要感染106的细胞，那么您共计需要107pfu的病毒. 如果病毒滴度为1×10¹⁰ pfu/mL, 那么您实验需要的病毒量就是1ul.

5. 腺病毒感染细胞之后多久可以从基因水平和蛋白水平检测表达？如果蛋白是分泌性蛋白和非分泌性蛋白，检测时间是否有区别？

腺病毒携带的目的基因表达快。如果您想从基因水平检测基因的表达，那么在病毒感染细胞12-24h之间进行检测；如果您想从蛋白水平检测基因的表达，那么在病毒感染细胞48-72h之间进行检测。

对于分泌性蛋白和非分泌性蛋白，检测时间一样。如果担心蛋白分泌出来，也可以将培养基也一起带着做western blot。

6. 腺病毒毒种被细菌污染了，没有多余毒种，也没有构建好的载体，怎么办？

因为腺病毒的直径大小是90-100nm，而细菌的直径大小要大的多，可以用22um的滤器进行过虑。如果您的病毒量很低，担心过虑后损失太多，无法进行后面的扩增工作，您可以先用污染了细菌的腺病毒直接扩增，当然扩增的结果是得到了污染了细菌的腺病毒，但病毒的量会提高一些，这样再用22um的滤器进行过滤。

7. 如何鉴定腺病毒递送的目的基因？

可以按照如下方法进行鉴定：

①针对基因设计引物，同时作为扩增和测序引物；

②将病毒用蛋白酶K处理后做为模板，如果是未纯化的病毒还需要过纯化柱处理掉培养基的成分；

③以处理过的病毒为模板进行PCR；

④用PCR引物对PCR产物测序。

8. 慢病毒、腺病毒、腺相关病毒三种病毒有什么区别？如何选择？

对于转染困难的细胞，科研工作者通常会选择病毒来导入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相关病毒是常用的病毒载体工具。那么如何选择适合您实验体系的病毒工具，请参考下面3种病毒工具的比较：

1、什么情况下选用慢病毒？

慢病毒的宿主范围比较广，既能感染分裂细胞，也能感染非分裂的细胞，在体内外研究中均可选择慢病毒作为病毒载体。此外，慢病毒也是构建稳转株的理想病毒。

2、慢病毒载体可插入多大的 ORF 片段？

一般情况下，慢病毒载体可容纳8 kb插入片段。然而，插入的ORF基因大于4 kb时会大大降低病毒的包装效率，进而影响病毒滴度甚至基因表达。

3、用于慢病毒感染的细胞接种量是多少？

将状态良好的目的细胞接种到24孔板，细胞浓度一般为1×10⁵/mL细胞，接种细胞数量需要考虑到细胞活力因素、状态因素、生长快慢因素、分裂因素等，一般是保证病毒感染时细胞汇合率达到50%-70%为佳。

4、什么是 MOI ？

MOI （multiplicity of infection），即感染复数，指的是感染时病毒与细胞数量的比值。一般认为MOI是一个比值，没有单位。

5、慢病毒是否能够稳定表达基因？

是的。慢病毒能将外源基因整合到宿主基因组中，不会随着细胞分裂传代而丢失，因此能实现外源基因的长期稳定表达。

6、维真慢病毒的包装周期是多久？

如果客户提供构建好的慢病毒载体，那么包装时间一般为2周左右，若包含前期载体构建等的时间，时间大概在5周左右。

7、慢病毒感染细胞后，目的基因的表达什么时间达到峰值？

慢病毒感染目的细胞后，一般情况下，在72-96h目的基因的表达能达到峰值，但是对于一些特殊细胞、如增殖传代比较慢的细胞，蛋白表达达到峰值则需要更长的时间。

8、怎样提高慢病毒的感染效率？

细胞良好的生长状态和感染时适合的 MOI 值是达到高感染效率的保证。一般可以通过提高感染时的 MOI 值来提高病毒的感染效率，必要时可在感染时加入助感染试剂ADV-HR来提高慢病毒的感染效率。

9、慢病毒感染后，细胞状态很差，甚至出现死亡，为什么？

慢病毒会对细胞造成一定的毒性，不同细胞对毒性的耐受力不同。建议调整并降低感染时使用的MOI值，即可在细胞准备时增加铺板细胞的汇合率（可提高至 70%），调整感染时加入的病毒量。此外，还可选择在感染4小时后换液，用新鲜的完全培养液继续培养观察。

10、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒三种病毒有什么区别？如何选择？

对于转染困难的细胞，科研工作者通常会选择病毒来导入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相关病毒是常用的病毒载体工具。那么如何选择适合您实验体系的病毒工具，请参考下面3种病毒工具的比较：