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Cre/LoxP重组系统

一.Cre/LoxP重组系统作用原理

1. Cre重组酶和LoxP位点

Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme)由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码,是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能够特异性识别loxP位点。

LoxP(locus of X-overP1)位点长为34bp,包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中,反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点,而间隔区域决定了loxP位点的方向。




图1. Cre重组酶和loxP位点


2. Cre/LoxP重组系统诱导基因重组的方式

Cre/LoxP系统存在几种诱导重组的方式,这是基于Cre重组酶与loxP位点的相互作用而实现的。

当基因组内存在loxP位点时,一旦有Cre重组酶,便会结合到loxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合,进而形成四聚体。随后,loxP位点之间的DNA被Cre重组酶切下,切口在DNA连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于loxP位点的位置和方向。主要存在几下几种重组方式:

(1) 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同,Cre重组酶敲除loxP间的序列;

(2) 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反,Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转;

(3) 两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上,Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位;

(4) 四个loxP位点分别位于两条DNA链或染色体上,Cre重组酶诱导loxP间的序列互换。


图2. Cre/LoxP诱导基因重组的方式

二.Cre/LoxP重组系统的优势

之所以Cre/LoxP重组系统在转基因动物方面得到广泛的应用,因其具有非常明显的优势。主要体现在:时空特异、高效性、准确性、快速性。

图3. Cre/LoxP重组系统的优势


三.Cre/LoxP重组系统在转基因中的应用

由于Cre/LoxP重组系统高效简单的作用方式,它已在基因定点删除、外源基因定点整合、疾病动物模型建立、筛选高效表达基因座等方面得到了有效利用,成为体内外DNA重组的有力工具。


图4. Cre/LoxP重组系统在转基因中的应用


四.病毒依赖的基因重组的优势

应用Cre/LoxP重组系统较为常见的形式是两种转基因动物的杂交。一般的策略为:

(1) 利用原核注射的方法获得转基因“Cre小鼠”。一般利用特定启动子控制此小鼠的Cre重组酶的表达;

(2) 通过置换型载体的同源重组,在胚胎干细胞中向靶位点引入选择标记基因,并在其两侧引入两个loxP位点,要求两条同源染色体都带有loxP位点,且不能干扰靶基因的转录。将此胚胎干细胞注入假孕母鼠中,发育成“floxed小鼠”;

(3)“Cre小鼠”与“floxed小鼠”交配,产生的后代体内,Cre重组酶会与loxP位点发生作用,导致基因重组。

虽然此法具备了Cre/LoxP重组系统的高效、特异的重组,但存在许多不足:

转基因动物的缺点:
● 成本高
● 耗时长
● 区域或组织特异型不高


目前,由于病毒依赖的基因重组能否克服转基因动物的诸多不足,从而成为越来越多科研工作者的新选择。病毒依赖的Cre/LoxP重组系统的策略为:

(1) 通过转基因动物办法获得一只“Cre小鼠”或“floxed小鼠”;

(2) 病毒注射此“Cre小鼠”或“floxed小鼠”,引入loxP或Cre重组酶元件。

此方法优势明显:

病毒依赖的基因重组的优势
● 更少的花费
● 更短的实验周期
● 更强的区域特异性


五.维真为您提供Cre/LoxP重组系统的AAV载体构建和病毒包装服务

1. 依赖Cre重组酶诱导表达的FLEX-ON系统

结合组织特异性的启动子和不同的AAV血清型,维真提供的FLEX-ON系统能帮您获得更精准的组织特异性控制和时间控制。

在FLEX-ON系统中,目的基因反方向位于启动子下方,两侧分别连接两个“头对头”的loxP。Cre重组酶不存在时,目的基因不能表达;当Cre重组酶存在时,可以诱导目的基因的“翻转”,从而表达。


图5. 维真提供依赖Cre的FLEX-ON系统示意图(左)维真的FLEX-ON实验图(右)

2. 依赖Cre重组酶反式剪接系统——轻松拥有“表达大基因的AAV”

较小的包装能力(小于5kb)使得AAV应用受到限制。维真为您提供依赖Cre的反式剪接系统,让您轻松拥有“表达大基因的AAV”。

多个重组AAV的共转染效率高达90%,维真将较大基因分为两部分构建于两个AAV载体上。通过ITR的重组、mRNA剪接和Cre/LoxP消除ITR的对转录的抑制作用,实现目的蛋白的表达。相比于单个载体维真提供的依赖Cre的反式剪接系统的表达效率约20%。


维真生物提供依赖Cre的反式剪接系统示意图(左)维真生物的依赖Cre的反式剪接系统实验图

图6. 维真提供依赖Cre的反式剪接系统示意图(左)维真的依赖Cre的反式剪接系统实验图(右)

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