CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)系统是细菌在噬菌体长期选择压力下，进化出的一种有效的获得性免疫机制。

CRISPR簇广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是一个特殊的DNA重复序列家族。其由一个前导区（leader）、多个重复序列区（repeat）和多个间隔区（spacer）构成。前导区被认为可能是CRISPR簇的启动子，重复序列区可形成发卡结构，间隔区由俘获的外源DNA组成。

CRISPR簇附近存在一个多态性家族基因，编码的蛋白质均具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性，并能与CRISPR区域发生相互作用，被命名为Cas（CRISPR associated）基因。

当外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体（pre-CRISPR RNA， pre-crRNA），并通过加工成为一系列含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，然后识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。

根据Cas蛋白质和参与序列的不同，将目前发现的CRISPR/Cas系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型需要多种Cas蛋白共同发挥作用，而Ⅱ型由Cas9单独参与，是研究较为深入的一种类型。

在pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）也转录出来。Cas9首先与crRNA和tracrRNA结合形成复合物，此复合物通过与PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-蛋白-DNA复合结构，进而在与crRNA配对的序列靶点剪切双链DNA。

通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（single guide RNA），通过将表达sgRNA的元件与表达Cas9的元件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，便能够对目的基因进行操作，以引导Cas9对DNA的定点切割。

CRISPR/Cas9系统的作用原理（Zhang Feng，2013）

CRISPR/Cas9系统需要两个关键基因序列：gRNA和Cas9，gRNA的功能是识别目的DNA序列，并引导Cas9蛋白到目的基因序列处进行切割。gRNA序列由两部分组成：能够与目的基因匹配的序列和能够与Cas9蛋白结合的序列。Cas9是一种能切割DNA双链的核酸内切酶，在匹配的基因的PAM序列的上游3-4碱基处进行DNA双链的切割。

根据PAM序列的不同，Cas9分为spCas9和saCas9两种。

saCas9基因序列长约3.3kb，spCas9基因序列长约4.1kb，因为saCas9的基因序列要比spCas9的基因序列短很多，所以在克隆方面，saCas9要更为容易，且saCas9更适宜包装成AAV病毒，当然两者都可以包装成腺病毒和慢病毒。saCas9和spCas9另外一个很大的区别是两者识别的PAM序列不同，saCas9识别的PAM序列是5’-NNGRRT-3’,而spCas9识别的PAM序列为5’-NGG-3’,因为saCas9的PAM序列要比spCas9的PAM序列长，在基因组中出现的概率更低，相比于spCas9脱靶率要低，其gRNA设计也相对更困难。