钙成像技术

神经元的活动是大脑复杂行为表现的基础。而神经元的活动会引起细胞内游离钙浓度的快速变化。钙离子作为一类重要的胞内信号分子，在神经元功能中起着重要的作用，如突触囊泡中神经递质的释放等。钙成像技术可以直接测量神经元和神经元组织中动态的钙流动，从而达到检测神经元活动的目的。

1、钙成像原理：利用特殊的荧光染料或钙离子指示剂，将神经元中钙离子浓度的变化通过荧光强度表现出来，通过对钙离子变化的快速成像，反映神经元的活性变化。

2、钙离子指示剂（Calcium Indicators）

对钙离子的功能研究，钙指示剂是必不可少的工具。根据荧光光谱、钙离子亲和力及其化学特性的不同大致可分为化学指示剂和遗传编码指示剂两大类。

化学指示剂是检测细胞质中钙离子浓度的传统工具，主要是一些能特异性与钙离子结合的小分子，包括Fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4、Calcium Green-1等，这些小分子都是被称作BAPTA的钙离子螯合剂，是乙二醇双四乙酸（EGTA）的一种同系物，对Ca2+具有较高的选择性。化学荧光指示剂通常采用电极刺穿或借助乙酰氧基甲酯和右旋葡萄糖的方式进入到目标部位。

遗传编码钙离子指示剂（genetically encoded calcium indicators，GECIs），是随着基因工程技术的发展，出现的一种新型的钙离子指示剂，它可以实现在体实验中对钙离子的长时程检测和实时动态检测，并且还可以借助细胞器的特异性定位信号表征某些特定的亚细胞结构的钙离子变化情况。

根据发光原理可将GECIs分为两大类，以单个荧光蛋白为基础的GECIs和由荧光共振能量转移（FRET）的荧光蛋白对构成的GECIs。前者主要包括Pericams、GCaMP和Camgaroos，后者主要包括TN-XXL、Cameleons、D3cpV等。GECIs类钙指示剂则主要借助于病毒感染的方式导入至目标部位。

遗传编码钙离子指示剂
（Jihae Oh et al. Korean J Physiol Pharmacol. 2019）

3、GCaMPs钙指示剂

在GECIs中，以结构导向设计的GCaMP应用最为广泛。GCaMPs是单个绿色荧光蛋白GFP、钙调蛋白CaM和平滑肌细胞肌球蛋白轻链激酶片段M13融合的产物。在Ca2+存在的情况下，CaM会和M13结合，大大增加荧光的强度。其结构示意图和成像原理如下图所示。

4、钙成像研究步骤

下面以遗传编码类钙离子指示剂为例，简述研究步骤：
第一步：选取合适的GECIs类钙离子指示剂；
第二步：通过病毒感染的方式将钙离子指示剂导入目标位置；
第三步：记录钙离子的动态变化，分析神经元活动。

5、如何选择合适的钙指示剂(以GCaMPs为例)

自2001年GCaMP1问世以来，科学家们通过基于结构的突变和基于神经元的筛选方法不断优化GCaMP的亲和性、信噪比、动力学和动态范围等，先后成功开发过GCaMP2,GCaMP3,GCaMP5、GCaMP6和jGCaMP7，以满足研究者不同的成像实验。那么，面对众多的GCaMPs钙指示剂，我们该如何选择呢？众所周知，不同的成像实验需要使用不同性质的GCaMP，如本底荧光低的GCaMP适用于宽视场成像技术，可以同时检测大量神经元的活动，这主要是由于大量神经元被GCaMP标记，光子数多，容易形成比较强的背景荧光；本底荧光高的适用于检测神经亚细胞的信号，如树突棘和轴突，这主要是由于这些神经亚细胞结构体积小，GCaMP表达少，光子数少，背景荧光低甚至可以被忽略；快动力学的GCaMP适合检测神经元放电模式的动态变化；慢动力学的GCaMP则适合检测所有活动的神经元。下表是GCaMP6和jGCaMP7系列探针的特点：

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8、参考文献：

1. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors；
2. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity；
3. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.