Nature子刊：中国药科大学金亮/张方方联合东南大学李玲团队揭示环状RNA在肥胖介导的胰岛β细胞功能障碍和凋亡中起重要作用

2023年1月21日，中国药科大学金亮、张方方教授及东南大学李玲教授共同通讯在Nature Communications（IF17.694） 在线发表题为“Circular RNA circGlis3 protects against islet β-cell dysfunction and apoptosis in obesity”的研究论文。文章强调了circRNAs在β细胞代偿中的生理作用，并表明调节circGlis3的表达可能是预防肥胖后β细胞功能障碍和凋亡的潜在策略。

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研究背景

2型糖尿病(T2DM)是糖尿病的主要形式，肥胖、衰老、饮食及遗传等风险因素导致了糖尿病的加速流行。T2DM经历了从代偿性胰岛素抵抗到β细胞衰竭，最终发展为无代偿性高血糖，胰腺β细胞代偿是延缓T2DM进展的主要机制。在肥胖和T2DM患者中β细胞凋亡增加，然而代偿期β细胞凋亡的预防机制尚不清楚。先前的研究表明不同类型的非编码RNA在β细胞代偿功能的调节中起着关键作用，并且在人类和小鼠胰岛中已经鉴定出数千种胰岛特异性环状RNA，但目前尚不清楚这些环状RNA在肥胖介导的β细胞功能障碍和凋亡中的作用。

研究结果分享

1、circGlis3在肥胖雄性小鼠胰岛中升高

作者对两种肥胖小鼠模型（HFD喂养小鼠及Lep^ob/ob小鼠）的胰岛进行了circRNA整体表达谱分析，发现之前已被注释的环状RNA circGlis3在胰腺中富集，并在HFD喂养的小鼠胰腺中显著上调。通过量化糖耐受损（IGT）和T2DM患者血清中circGlis3的表达水平，作者注意到在β细胞功能代偿的肥胖和中度糖尿病个体中，人血清中circGlis3的表达水平明显升高，而在失代偿期circGlis3的表达水平下降。以上数据表明在饮食和遗传肥胖小鼠模型中，以及IGT和/或T2DM个体中，胰岛中的circGlis3水平升高。

图1. circGlis3在肥胖个体中上调，并与肥胖相关

2、剪接因子QKI调控circGlis3的形成

小鼠circGlis3基因来源于Glis3基因的外显子3，长1114 nt，测序分析证实circGlis3存在BSJ位点。随后对circGlis3的形成机制进行了探究，基于剪接因子调节circRNA的生物发生研究，作者分析了HFD喂养小鼠胰岛中一组候选剪接因子的表达水平，发现肥胖小鼠的QKI在mRNA和蛋白水平上均有升高，并且QKI mRNA的表达水平与HFD喂养小鼠胰岛中circGlis3的表达水平呈正相关。下拉试验等证实Glis3外显子3两侧的内含子与QKI蛋白之间存在相互作用，QKI通过结合Glis3中环状RNA形成外显子3的上游和下游，促进circGlis3的形成。

图2. 剪接因子QKI调控circGlis3的形成

3、体外上调circGlis3促进胰岛素分泌，减轻β细胞凋亡

为探索circGlis3在调节β细胞功能中的潜在作用进，作者对MIN6细胞和原发胰岛中的circGlis3进行了敲低和过表达，circGlis3的过表达显著增加胰岛素基因Ins1和Ins2的mRNA水平和胰岛素含量，而敲低circGlis3的结果相反。在暴露于高糖或棕榈酸盐后，抑制circGlis3的表达会降低胰岛素分泌，而过度表达circGlis3则会显著增加胰岛素分泌。进一步分析发现circGlis3的过表达显著增加了转录因子CREB1和NeuroD1的表达水平，表明导致胰岛素含量增加的过程发生在转录水平。Annexin V/PI染色染色和TUNEL实验结果表明，下调circGlis3会增加凋亡细胞的数量，而过表达circGlis3则会导致相反的结果。上述结果表明，circGlis3上调可缓解肥胖过程中β细胞凋亡。

图3. 上调circGlis3可促进胰岛素分泌，抑制β细胞凋亡

4、体内上调circGlis3可改善β细胞功能障碍，抑制β细胞凋亡

接下来，作者检测了circGlis3过表达是否能缓解肥胖诱导的β细胞功能障碍，将AAV8-MIP-circGlis3通过胰腺导管给药方式注入8周龄雄性C57BL/6小鼠体内，并进行高脂饮食喂养。AAV8-circGlis3处理的HFD小鼠胰岛素抵抗指数显著降低，且胰岛素原与胰岛素的比值明显受到抑制，结果证实过表达circGlis3可改善β细胞的生物学功能以及糖耐量。胰岛素耐量试验(IPITT)表明，上调circGlis3可改善胰岛素敏感性，GSIS数据表明AAV8-circGlis3治疗可增强胰岛素分泌，此外，circGlis3的过表达显著减少了凋亡β细胞的数量。不仅如此，作者在 Lepr^db/db小鼠体内也观察到了与之相同的结果。表明circGlis3在饮食型和遗传型肥胖小鼠模型中过表达可改善β细胞功能，抑制β细胞凋亡，证实circGlis3对葡萄糖稳态的影响是由β细胞介导的。

图4. 体内上调circGlis3可改善β细胞功能障碍，抑制β细胞凋亡

5、circGlis3促进胰岛素分泌，抑制β细胞凋亡的机制研究

circRNA可能作为竞争内源性RNA(ceRNAs)来海绵miRNA，从而影响miRNA对靶mRNA的负调控。结合不同数据库分析预测了4个miRNA可能是circGlis3的靶点，HFD喂养小鼠和Lep^ob/ob小鼠的胰岛中，只有miR-124-3p和miR-298-5p表达显著升高，RNA下拉和RNA原位杂交等实验进一步表明circGlis3作为miR-124-3p的海绵，上调转录因子NeuroD1和Creb1的表达，从而促进胰岛素的转录和分泌。

SCOTIN是一种促凋亡因子，在响应DNA损伤或细胞应激时以Caspase依赖方式被激活。作者证实circGlis3通过与SCOTIN相互作用，抑制Caspase 3的活性，以Caspase依赖性的方式防止肥胖过程中β细胞的凋亡。

图5. circGlis3通过靶向和海绵miR-124-3p调节胰岛素转录

6、在糖尿病中FUS抑制circGlis3胞质扩散以降低其丰度

最后，作者研究了circGlis3在糖尿病期间表达水平降低的原因。下拉实验等分析发现FUS可能对circGlis3存在调控作用，FUS是一种70 kDa的RNA结合蛋白，可能在细胞核和细胞质之间穿梭以响应应激。进一步验证发现，在棕榈酸盐刺激下过表达FUS可逆转circGlis3对miR-124-3p的抑制作用，并竞争性地抑制SCOTIN对circGlis3的富集。研究表明，在细胞应激过程中核蛋白FUS会快速组装细胞质应激颗粒(SG)，SG可以限制mRNAs和ncRNAs的扩散。作者对HFD喂养小鼠施加棕榈酸刺激，发现脂毒性可导致FUS在细胞质和细胞核中分散分布，并发生大量的SG组装，抑制SG的组装可挽救细胞质中circGlis3的表达。这些数据表明在糖尿病的发展过程中，FUS与miR-124-3p和SCOTIN竞争结合circGlis3，通过形成SG限制circGlis3在细胞质中的扩散，导致circGlis3减少。

图6. FUS通过组装胞浆SG分离circGlis3，降低其在糖尿病中的丰度

小结

研究发现circGlis3在肥胖相关β细胞功能障碍的发展中起着至关重要的作用。circGlis3过表达可上调胰岛素的转录和分泌，改善糖耐量异常和β细胞凋亡，证明了circGlis3延长了β细胞代偿期，延缓了T2DM进程，揭示circGlis3的升高将是T2DM的一个很有前景的诊断和治疗靶点，为circRNA调控在糖尿病中的功能重要性带来了新的维度！