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脑是人体最神秘、最复杂的器官，由近1011个神经元组成，形成约1014-15个突触，这种复杂的神经环路网络为认知、情感、记忆、感觉和运动等大脑高级功能建立了稳固的结构基础。如何认识神经元的连接方式，描绘神经环路的精细结构并认知其功能对于了解大脑的复杂功能至关重要。科学家们一直致力于找到可以特异性标记细胞种类、传导方向可控、可视化的示踪工具，以期实现对神经环路网络的精确认识和研究。
利用神经示踪工具实现对神经环路的精确标记，主要涉及两大基本问题即方向性（顺向、逆向）和是否跨突触。顺向(Anterograde)是由注射部位的神经元胞体经轴突下行至末梢，逆向(Retrograde)是由轴突末梢传到细胞体；顺向跨突触是从胞体传到轴突末梢后跨过突触传递至下一级神经元，逆向跨突触跟顺向跨突触相反，是由胞体逆向跨突触传递至上一级神经元的轴突。如下图所示：
（Strick P L，et al.，eLS，2011）
小V带领大家一起了解神经环路示踪工具的发展历程，共同感受神经科学研究领域的飞速进步。
传统神经示踪工具
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种类 |
名称 |
特点 |
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辣根过氧化物酶 |
辣根过氧化物酶(HRP) |
逆行示踪剂，染色局限于细胞体和初生树突 |
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蛋白 |
霍乱毒素B亚基(CTb) |
逆行示踪剂，无毒 |
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荧光染料 |
荧光金(Fluoro Gold)
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逆行示踪剂，显示树突分支，易观察，不易扩散 |
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羰化青（Dil） |
逆行示踪剂，显示轴突，荧光强而稳定，无毒，不易扩散 |
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生物素 |
生物素化葡聚糖胺（BDA）
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顺行示踪剂，保存时间长，可与多种荧光示踪剂及免疫组化技术相结合 |
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凝集素 |
麦芽凝集素（WGA）、菜豆凝集素(PHA) |
顺行示踪剂，注射后需要较长的存留时间才能实现转运 |
上述这些传统的示踪剂被广泛用于确定实验动物不同脑区之间神经元的连接，促进了人们对大脑神经网络结构的认识，但它们仍有以下缺点：①无法特异性标记细胞类型；②几乎没有跨突触能力；③不能用于传递外源基因；难以用于多个脑区、多种类型神经元通过突触连接形成的复杂神经网络研究。
病毒示踪剂的出现为上述问题的解决提供了新方案，并成为追踪神经网络连接的有效工具。
病毒示踪工具
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病毒名称和描述 |
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顺向跨突触病毒 |
HSV |
dsDNA，~152kb，包装容量~130kb。毒力和传播方向具有菌株依赖性。H129株优先顺向跨突触示踪 |
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VSV |
-ssRNA，11-12kb，包装容量<6kb。对人的毒性较低，极短时间高丰度表达目的蛋白，可被其他病毒的囊膜糖蛋白包装而获得不同方向的跨突触能力 |
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逆向跨突触病毒 |
RV |
-ssRNA，11.9kb，包装容量<6kb。主要标记神经元，可导致致命的人畜共患疾病。改造的复制缺陷型RV毒性较低 |
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PRV |
dsDNA，~150kb，包装容量~130kb。不能感染高等灵长类；野生型PRV毒性极高且双向传播。改造的PRV-Bartha株逆行跨突触示踪，毒性较低 |
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AAV血清型种类多，不同的血清型对神经元有不同的感染特性。神经科学研究中常用的AAV血清型有2、5、8、9、DJ、1/2、PHP、Anc80等，它们有高效转导神经元的能力，可根据标记的神经元选择合适的AAV血清型。此外，科学家也一直致力于AAV新血清型的开发研究，近日国际基因治疗领域著名专家高光坪教授及其课题组鉴定出一种新AAV血清型AAVv66，其与AAV2具有高度序列相似性，但比AAV2产率更高、病毒稳定性更高及更好的中枢神经系统转导能力，通过颅内和全身注射给药时，AAVv66在脑组织内分布较AAV2更好。
常见的AAV病毒载体都是顺向非跨突触标记，AAV的逆向非跨突触和顺向跨突触标记能力在科学家的潜心研究下取得了满意成果，并被广大研究者用于神经环路研究：
rAAV2-retro（逆向非跨突触标记）
2016年D. GowanlockR. Tervo等通过定向进化的方法构建了一种新的AAV变体— rAAV2-retro，该变体具有逆行示踪能力且效率与传统的逆行示踪剂相当，由此AAV的逆向非跨突触标记能力被成功开发。下图所示为rAAV2-retro的开发过程及应用实例：
AAV1（顺向跨突触示踪）
2017年张砺教授团队研究报道AAV1在高滴度条件下呈顺向跨突触传播，与Cre依赖的报告系统相结合，可高效和特异性地驱动Cre依赖的外源基因在突触后神经元中表达，标记突触后神经元。2020年该研究团队再次深入研究了AAV1顺向跨突触标记的作用机制——依赖于突触囊泡的释放，同时揭示了其在多种神经环路中的广泛应用，为AAV作为顺向跨突触示踪病毒工具对神经元及其投射脑区进行标记提供了诸多证据。我们相信AAV在神经环路中的应用将会越来越广泛。（研究所用的AAV病毒部分由维真生物提供，欲知详情请点击往期回顾：科讯前沿：南加利福尼亚大学张砺教授团队在AAV1顺向跨单级突触研究领域发表新成果！）
AAV转导神经元需要宿主细胞合成其基因的互补链，因此基因的高表达需要较多病毒颗粒和较长时间才能实现。双链AAV(self-complementary AAV，scAAV) 进入细胞后，不需要由单链变为双链的过程，基因表达更为快速，表达水平更高，不过scAAV的装载量只有单链AAV的一半。例如2020年张砺教授团队的科研论文就使用了scAAV，证实了scAAV1-hSyn-Cre具有更优越的顺向跨突触标记能力，可在兴奋性、抑制性、神经调质和脑-脊髓等多种神经环路中有效、特异地标记单突触靶神经元及其输出，从而解析不同的功能/行为。
总 结
维真生物神经示踪工具AAV产品及服务
如有需要，欢迎致电400-077-2566！
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产品编号 |
产品名称 |
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AV204006-AVretro |
AAVretro-hSyn-Cre |
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AV204006-AV1 |
AAV1-hSyn-Cre |
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AV204046-AV1 |
scAAV1-hSyn-Cre |
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AV204006-AV2retro |
AAV2 retro-hSyn-Cre |
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AV204049-AV1 |
AAV1-hSyn-Flp |
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AV204050-AV1 |
AAV1-CAG-DIO-Flp |
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AV204054-AV1 |
AAV1-EF1a-DIO-Flp |
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…… |
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荧光蛋白（标记神经元） |
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AV200001-AV2retro |
AAV2 retro-CMV-GFP |
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AV200007-AV2retro |
AAV2 retro-hSyn-GFP |
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AV200109-AV1 (Cre依赖) |
AAV1-CAG-DIO-GFP |
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AV200160-AV2 (Cre依赖) |
AAV2-CAG-DIO-mCherry |
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AV200145-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-EF1a-DIO-mCherry |
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AV200096-AV2 (Cre依赖) |
AAV2-hSyn-DIO-GFP |
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AV200096-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-hSyn-DIO-GFP |
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AV200146-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-hSyn-DIO-mCherry |
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AV200117-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-CaMKIIa-DIO-GFP |
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AV200147-AV5 (Cre依赖) |
AAV5-CaMKIIa-DIO-mCherry |
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AV200147-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-CaMKIIa-DIO-mCherry |
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…… |
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光遗传学(操控神经元) |
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AV201006-AV2 (Cre依赖) |
AAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
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AV201006-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
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AV201007-AV2 (Cre依赖) |
AAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP |
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AV201007-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP |
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AV201017-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-EF1a-DIO-eArch3.0-EYFP |
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AV201021-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-EF1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP |
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AV201003-AV2 (Cre依赖) |
AAV2-CaMKIIa-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
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…… |
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化学遗传学(操控神经元) |
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AV202014-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
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AV202010-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
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AV202015-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-CaMKIIa-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
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…… |
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钙指示剂(神经元成像) |
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AV203009-AV2retro (Cre依赖) |
AAV2-retro-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203006-AV8 (Cre依赖) |
AAV8-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
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AV203006-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
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AV203009-AV8 (Cre依赖) |
AAV8-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203009-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203009-AV DJ (Cre依赖) |
AAV-DJ-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203016-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato |
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AV203004-AV5 (Cre依赖) |
AAV5-hSyn-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
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AV203046 |
AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7b-P2A-nls-dTomato |
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AV203047 |
AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7c-P2A-nls-dTomato |
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AV203048 |
AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7s-P2A-nls-dTomato |
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AV203049-AV9 (Cre依赖) |
AAV9-EF1a-DIO-jGCaMP7f-P2A-nls-dTomato |
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…… |
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另有AAV9、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB等可跨血脑屏障的血清型AAV产品。关注我们了解更多产品详情~
Reference
1. Saleeba, C., et al., A Student's Guide to Neural Circuit Tracing. Front Neurosci, 2019. 13: p. 897.
2. Sun L, Tang Y, Yan K, et al. Differences in neurotropism and neurotoxicity among retrograde viral tracers. Mol Neurodegener. 2019;14(1):8. Published 2019 Feb 8. doi:10.1186/s13024-019-0308-6.
3. Li J, Liu T, Dong Y, Kondoh K, Lu Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neurosci Bull. 2019;35(5):909-920. doi:10.1007/s12264-019-00374-9.
4. Zingg, B., et al., AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron, 2017. 93(1): p. 33-47.
5. Brian Zingg, Bo Peng, Junxiang Huang, Huizhong W. Tao, and Li I. Zhang(2020) Synaptic Specificity and Application of Anterograde Transsynaptic AAV for Probing Neural Circuitry. The Journal of Neuroscience 40 (16): 3250-3267.
6.Tervo et al.,A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons .Neuron .2016, 92, 372–382.
7.Hsu, H., Brown, A., Loveland, A.B. et al. Structural characterization of a novel human adeno-associated virus capsid with neurotropic properties. Nat Commun 11, 3279 (2020).
400-077-2566
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