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论文标题：In vivo multiplex imaging of dynamic neurochemical networks with designed far-red dopamine sensors
发表期刊：Science
合作客户：北京大学 李毓龙教授团队
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AAV9-hSyn-HaloDA1.0（7.73×1013 vg/ml）、AAV9-hsyn-hChR2(H134R)-mCherry（2.53×1013 vg/ml）、 AAV9-EF1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP（9.12×1013 vg/ml）、AAV9-hSyn-NE2m（1.39×1013 vg/ml）、 |
神经调质如多巴胺（DA）通过与乙酰胆碱（ACh）、5-羟色胺（5-HT）等互作调控脑功能，但现有荧光传感器局限于绿/红光范围，难以实现多色同步成像。2025 年 6 月 5 日，北京大学李毓龙实验室联合国内外多个团队，在 Science 杂志在线发表了题为 In vivo multiplex imaging of dynamic neurochemical networks with designed far-red dopamine sensors 的文章，研究开发了一种远红光多巴胺探针 HaloDA1.0，其结合了 cpHaloTag 化学染料和 GRAB 策略，具备高灵敏度、亚秒级响应动力学及远红至近红外光谱范围。HaloDA1.0 可与现有红绿荧光传感器联用，在培养神经元、脑片和行为动物中实现多巴胺与其他神经调质及钙离子、cAMP 的多色成像，揭示了多巴胺在神经化学网络中的动态互作机制，为解析复杂脑功能提供了新工具。
研究团队将人 D1 受体（D1R）的第三胞内环（ICL3）替换为优化的环形排列 HaloTag 蛋白（cpHaloTag），结合远红光染料（主要是 JF646），通过筛选 2000 多个变体，优化插入位点、linker 序列及关键氨基酸残基，成功开发了远红光多巴胺探针 GRABHaloDA1.0（简称为 HaloDA1.0）。体外验证 HaloDA1.0 在 HEK293T 细胞中定位于质膜，加入 DA 后荧光强度瞬时升高，最大荧光变化（ΔF/F0）约 900%，半最大有效浓度（EC50）为 150 nM。通过测试多种罗丹明衍生物，发现不同染料可调节传感器光谱、响应强度和亲和力。随后，研究团队表征了 HaloDA1.0 在 HEK293T 细胞和培养的神经元中表达时的药理学特性，动力学以及与下游通路的偶联，结果显示该传感器对 DA 具有高灵敏度和特异性，具有快速响应动力学，且不与下游信号通路偶联。重要的是，在培养神经元中同时表达 HaloDA1.0（远红光）、红色 5-HT 传感器（r5-HT1.0）和绿色 NE 传感器（NE2m），成功实现三种单胺类神经递质的实时同步监测，信号间无显著串扰。
为评估 HaloDA1.0 是否可以检测内源性 DA 释放，将表达 HaloDA1.0 的 AAV 注射至小鼠 NAc，3 周后制备急性脑片，经 JF646 染料标记后，通过电刺激诱发 DA 释放。结果显示 20 Hz 电刺激可触发 HaloDA1.0 荧光强度快速升高，响应幅度与刺激脉冲数正相关，单个脉冲即可检测到 DA 释放；使用 D1R 拮抗剂 SCH 可完全阻断荧光信号，证实信号源于内源性 DA 释放。在 NAc 共注射表达 HaloDA1.0、rACh1h 和 eCB2.0 的 AAV，能够灵敏报告电刺激引起的多巴胺、乙酰胆碱和内源性大麻素的内源动态变化，揭示了三者差异化的释放动力学特征。此外，研究团队还构建了同时表达绿色 ATP 探针、红色钙探针和远红 HaloDA1.0 探针的转基因斑马鱼。结合三色成像，研究人员在斑马鱼电击刺激和癫痫样行为过程中，实时观察到多巴胺、胞外 ATP 及神经元钙信号呈现同步化的释放或活动，并且三者在信号消退阶段表现出不同的下降速率。
在小鼠体内使用基于 cpHaloTag 的传感器需要将染料递送到小鼠大脑，为了优化 HaloDA1.0 的性能，研究团队在体内系统地比较了各种远红染料。在 VTA 中表达视紫红质-2，并在 NAc 中表达了 HaloDA1.0，其接收来自 VTA 的密集多巴胺能投射。在小鼠 VTA 注射表达光遗传学激活蛋白 ChR2 的 AAV，同时在 NAc 或 mPFC 表达 HaloDA1.0，通过尾静脉注射不同远红光染料标记传感器，利用光纤记录 DA 动态。结果显示，SiR650 标记的 HaloDA1.0 探针可以在多巴胺能神经元投射丰富的伏隔核和投射稀少的大脑皮层，均能特异性检测光遗传激活多巴胺神经元引起的多巴胺释放。进一步地，研究团队利用三光纤同步记录小鼠在自发活动、糖水奖赏、足部电击和可卡因注射条件下，DA、ACh 和 D1 中型多棘神经元（D1-MSN）内 cAMP 动态。结果显示在生理行为过程中，多巴胺与乙酰胆碱通过协同作用对 cAMP 进行调控，然而在可卡因刺激条件下，二者对 cAMP 的调控呈现拮抗效应。
本研究成功开发了远红光的多巴胺探针 HaloDA1.0，这一新型探针可在细胞、脑片、斑马鱼及小鼠多系统中，灵敏且特异地报告多巴胺的动态变化。通过与绿色和红色荧光探针联合应用，HaloDA1.0 让研究者得以同步捕捉多种神经化学分子的变化，深入解析它们的时空动态特征和调控关系。这项成果是跨学科合作的重要产物，既拓展了活体化学研究的边界，也为解析大脑复杂的神经递质调控网络提供了有力支持。
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