AAV-PCSK9让你的动脉粥样硬化造模更简单！

1. 动脉粥样硬化简介

目前，心脑血管疾病在人群中的发病率越来越高，其发病基础主要是动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）。动脉粥样硬化是一种慢性进行性疾病，发病机理非常复杂，目前尚未明了，有多种学说从不同角度来阐明，诸如脂肪浸润学说、血栓形成和血小板聚集学说、损伤反应学说和克隆学说等，近年来，内皮损伤学说逐渐被公认。即多种因素使内皮细胞受损，使动脉内膜的完整性受到破坏，加上脂质代谢紊乱，血液中的脂蛋白从受损的内皮细胞进入动脉壁，引起平滑肌细胞的增生，随着脂质的不断沉积和平滑肌细胞的持续增生，并经过一系列复杂的连锁反应和恶性循环形成动脉硬化。尽管现代医学的不断发展为其治疗提供了很多选择，但它仍然是世界范围内的造成死亡的主要原因之一，因此，研究动脉粥样硬化的发病机制及其影响因素尤为重要。

2. PCSK9简介及其在动脉粥样硬化中的作用

PCSK9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9），前蛋白转化酶枯草溶菌素转化酶9，kexin样前转化酶枯草杆菌蛋白酶家族的第九个成员，定位于1p32.3染色体，由692个氨基酸组成，是脂质稳态的一个关键调控因子。PCSK9属于细胞内“转化酶”或脱羧酶, 在啮齿类动物中，PCSK9主要在成年肝细胞中表达，在小肠和肾脏中表达较少，在发育中的中枢神经系统中短暂表达；在成人中，PCSK9主要在肝脏中表达, 在小肠、肾脏、脑等中也有少量表达。研究表明，PCSK9在内皮细胞，血管平滑肌细胞和巨噬细胞中有较高水平的表达，对血管稳态和动脉粥样硬化斑块产生局部影响。

肝脏是脂蛋白转运和代谢的主要部位，肝细胞通过低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor, LDLR）的主要调节因子PCSK9来控制血液中的低密度脂蛋白（LDL）水平。PCSK9由肝脏分泌到血浆中，与肝细胞表面的LDLR结合，构成复合物并靶向转运到溶酶体内进行降解, 从而阻断LDLR在细胞膜表面的循环途径, 使得血浆中LDL升高, 最终导致动脉粥样硬化。此外，PCSK9还会诱导炎症细胞因子、粘附分子和趋化剂的表达，从而增加单核细胞的募集、炎症细胞的粘附和动脉粥样硬化血管壁的炎症。目前，PCSK9已经成为降脂药物研发及动脉粥样硬化干预的热门靶点。

图1. PCSK9与肝细胞LDLR结合
（Alkindi M, Siminovitch KA,et al. Can J Cardiol, 2016）

3. AAV-PCSK9 造模方法

动脉粥样硬化模型对于我们了解疾病的发病机制，并开发其治疗方法具有重大意义。目前，载脂蛋白E缺陷（ApoE-/-）和低密度脂蛋白受体缺陷（LDLR-/-）小鼠是应用比较广泛的动脉粥样硬化小鼠模型，但是，这些通过生殖系基因工程技术在小鼠内建立的模型需要复杂而耗时的回交。近年来，科学家建立了一种快速、简便、通用和经济有效的无种系遗传工程的建模方法：单次静脉注射AAV-PCSK9DY。

PCSK9的功能获得性突变PCSK9DY可以诱发高胆固醇血症，研究表明，PCSK9DY与 LDLR的体外亲和性相比野生型 PCSK9至少高出10倍， 其诱发高胆固醇血症的作用更强。为了实现长期的高胆固醇血症，研究者将不同剂量的重组腺相关病毒载体（人源及小鼠PCSK9DY载体设计图见图2）注射至C57BL/6NTac小鼠中，然后进行高脂饮食，12周后，小鼠出现动脉粥样硬化，主要表现在主动脉弓或主动脉根（图3）。

图2. PCSK9DY载体示意图

图3. AAV-PCSK9DY诱导小鼠动脉粥样硬化
（Bjorklund，M .M ., et al. Circulation Research, 2014）

4. 维真AAV-PCSK9应用实例

“Smooth muscle-specific HuR knockout induces defective autophagy and atherosclerosis ”【点击查看原文】

人类抗原R(Human antigen R，HuR)是一种广泛存在的RNA结合蛋白，参与多种疾病的动态调节和病理过程，但是其在AS中的作用尚不明确。在这项研究中，作者建立了平滑肌特异性HuR基因敲除的小鼠模型(HuRsmko)，以研究HuR在动脉粥样硬化中的作用。发现HuR在动脉粥样硬化斑块中的表达降低，与对照组相比，HuRsmko小鼠在动脉粥样硬化模型中显示出更多的斑块。HuR能与AMPKα1和AMPKα2结合，增加其稳定性和蛋白表达。HuR缺乏降低了p-AMPK和LC3II水平，增加了p62水平，从而导致自噬缺陷。而药理学AMPK激活诱导HuRsmko小鼠的自噬并抑制动脉粥样硬化。本研究表明，平滑肌HuR可以通过增加AMPK介导的自噬，对动脉粥样硬化起到保护作用。

为研究HuR在AS中的作用机制，研究人员构建了平滑肌特异性HuR基因敲除（HuRsmko）小鼠模型，然后注射rAAV/D377Y-mPCSK9载体并喂食Paigen饲料12周以诱导动脉粥样硬化。发现HuRsmko小鼠的动脉粥样硬化表面病变比例明显高于对照组，且主动脉根病变面积显著增加。同时，HuR的缺失增加了巨噬细胞的积累和基质金属酶2（MMP2）的水平，降低了胶原含量，表明VMSC中HuR的缺失促进了动脉粥样硬化的发展（图4）。

图4. 平滑肌细胞中HuR缺失加重动脉粥样硬化

5. 维真AAV-PCSK9现货供应

随着研究的不断深入，PCSK9腺相关病毒注射配合高脂高胆固醇饮食，已经逐渐成为动脉粥样硬化的理想造模方式。

维真生物拥有人源、鼠源过表达PCSK9腺相关病毒（AAV-PCSK9），供动脉粥样硬化研究者造模使用，现货供应，质量有保证。详情垂询【400-077-2566】或添加【维真小助手微信号WZ4000772566】咨询。关注维真生物，让维真产品助您科研一路顺畅！

6. AAV-PCSK9参考文献

1. Seidah N G , Awan Z , Chretien M , et al. PCSK9: a key modulator of cardiovascular health.[J]. Circulation Research, 2014, 114(6):1022-1036.

2.Alkindi M, Siminovitch KA, Gupta M, et al.Monoclonal antibodies for the treatment of hypercholesterolemia:targeting PCSK9[J].Can J Cardiol, 2016, 32 (12) :1552-1560.

3.Bjorklund M M , Hollensen A K , Hagensen M K , et al. Induction of atherosclerosis in mice and hamsters without germline genetic engineering.[J]. Circulation Research, 2014, 114(11):1684-1689.

4.Liu S , X Jiang, X Cui, et al. Smooth muscle-specific HuR knockout induces defective autophagy and atherosclerosis[J]. Cell Death & Disease, 2021, 12(4):385.