IF 40.8｜中国医学科学院胡盛寿/李向杰/宋江平团队发现PKNOX2是一种新型心肌纤维化转录因子

已有大量研究试图通过单核RNA测序来揭示人类心脏的细胞异质性，但由于转录因子检测的局限性，心脏转录调节网络尚未被系统的描述。中国医学科学院北京协和医学院胡盛寿院士、李向杰副研究员和宋江平教授共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy (IF 40.8)上发表文章“PBX/Knotted 1 homeobox-2 (PKNOX2) is a novel regulator of myocardial fibrosis”，研究开发了一个强大的无偏倚的组织处理和单核转录组分析管道，提高了更多的转录因子和参与信号通路的基因的检测；并表征了健康心脏的细胞组成，确定了主要决定细胞亚型身份和功能的转录调控网络。其中一种新的调节因子PKNOX2被证明在成纤维细胞激活过程中具有纤维化抑制效力。

1. 健康心脏成纤维细胞群与转录调控

作者建立了一个组织加工管道，用于核分离和snRNA-seq，并发现这种优化的snRNA-seq技术应用于成人心脏的基因检测结果优于scRNA-seq技术，具有良好的稳健性和可重复性。通过这种无偏倚的方案，作者表征了健康人类心脏的细胞组成，并研究了参与决定主要心脏细胞亚型的细胞身份和功能的转录调节网络。在表征健康心脏成纤维细胞群与转录调控中，作者发现一种新的调节因子PKNOX2与健康心脏中成纤维细胞的生理激活有关。

2. PKNOX2在衰竭心脏纤维化过程中的转录失调

作者接下来验证这些转录因子在维持体内平衡中的作用，对移植衰竭心脏进行了snRNA-seq分析。发现与健康对照相比，移植衰竭心脏的成纤维细胞中鉴定出8个具有不同基因特征和丰富功能的成纤维细胞亚簇。伪时间分析观察到从间充质基质细胞样纤维母细胞（FB）到病变FB存在两条主要轨迹，表明心力衰竭中存在复杂的多向重构。轨迹1显示纤维化评分从基底成纤维细胞到myoFB呈梯度增加，这可能反映了心肌纤维化形成过程起源于常驻成纤维细胞，此外POSTN和MEOX1的表达在成纤维细胞激活起始时间开始增加，而PKNOX2的表达在此时达到峰值，并从活化的FB到myoFB逐渐下降，这些结果提示PKNOX2可能具有负调控作用，特别是在从生理激活到病理性纤维化的过渡阶段。为了验证PKNOX2在心肌重构过程中的表达模式，作者检测了供体心脏左心室心肌、DCM心脏左心室心肌(DCM LV)和DCM心脏右心室心肌(DCM RV)的蛋白表达。发现PKNOX2在DCM RV成纤维细胞中显著增加，并与POSTN共定位，但这种增加在严重纤维化的DCM LV成纤维细胞中消失。

3. 体外过表达PKNOX2抑制成年小鼠心脏成纤维细胞活化

为了验证PKNOX2在成纤维细胞活化和纤维化形成中的功能，作者在体外和体内进行了功能丧失和功能获得的研究。使用siRNA在永生化成年小鼠心脏成纤维细胞(AMCF)中敲低PKNOX2的表达，发现SMAD2的表达和磷酸化水平均上调，同时纤维化标志物a-SMA的表达增加，提示纤维化TGF-β-SMAD2通路的激活导致PKNOX2功能不足。此外Pknox2的敲低可以诱导纤维化激活达到与TGF-β刺激相同的水平。但在Pknox2敲低的基础上，TGF-β刺激并没有诱导纤维化的增量激活。作者还通过Adv-PKNOX2 (维真提供)在AMCFs中过表达PKNOX2，发现与对照组相比，纤维化激活标志物(Postn, Col3a1, Ltbp2)在PKNOX2过表达的细胞中被显著抑制。通路富集分析显示，下调基因参与细胞外基质组织、间充质细胞分化和胶原原纤维组织，而上调基因与细胞增殖相关。此外PKNOX2过表达抑制TGF-β诱导的纤维化基因表达和SMAD2通路激活。

4. PKNOX2过表达抑制TAC诱导的小鼠心脏纤维化

为了证实PKNOX2在病理性心肌纤维化中的作用，作者构建了成纤维细胞特异性PKNOX2敲除小鼠，并通过主动脉横缩(TAC)手术诱导心力衰竭模型。发现TAC术后4周，Pknox2 CKO小鼠的心重/体重比明显高于对照组。体内超声心动图评价证实，与对照组相比，Pknox2-CKO小鼠心肌功能下降，左心室增大。Masson染色显示，Pknox2-CKO小鼠TAC诱导的心脏纤维化也明显加重。Pknox2-KO小鼠中与纤维化和心力衰竭相关的基因和蛋白的表达也明显上调。以上表明，PKNOX2的功能丧失加重了压力过载引起的心脏纤维化和功能障碍。随后作者利用AAV9-Postn-Pknox2-GFP（维真提供）在体内过表达PKNOX2，发现PKNOX2过表达小鼠的心脏重量/体重比明显低于对照组，心肌功能得到有效改善，并且减轻了TAC诱导的纤维化，纤维化和心力衰竭相关基因的表达也明显下调。总体而言，这些结果表明Pknox2过表达减轻了压力过载诱导的心脏纤维化。