武汉大学人民医院文重远/李俊峰研究团队揭示DNER在胰岛素信号调节肝糖异生中的关键作用
肝胰岛素抵抗导致肝糖异生增加，是2型糖尿病（T2DM）空腹高血糖的主要原因，然而其潜在的信号机制仍有待探索。Delta/Notch样表皮生长因子（EGF）相关受体（DNER）最初被描述为神经元特异性Notch配体，最近被确定为T2DM的易感基因，暗示DNER在胰岛素信号通路中有潜在的作用。2024年3月27日，武汉大学人民医院文重远/李俊峰研究团队在Molecular Metabolism (IF 8.1)期刊发表题为“Tyrosine-phosphorylated DNER sensitizes insulin signaling in hepatic gluconeogenesis by inducing proteasomal degradation of TRB3”的文章。研究发现DNER通过泛素-蛋白酶体降解途径抑制内源性Akt抑制剂TRB3，从而增强肝糖异生中的胰岛素信号传导，揭示了DNER在肝糖异生中的作用及其胰岛素增敏作用。
研究方法与结果
1、体内外敲低DNER降低胰岛素诱导的Akt-FoxO1-G6Pase/PEPCK信号通路的激活
与C57BL/6J小鼠相比，ob/ob和db/db小鼠的胰岛素靶组织中（肝脏、骨骼肌及内脏脂肪组织）DNER和磷酸化Akt下调，而TRB3上调，表明DNER蛋白水平与Akt磷酸化呈正相关，而TRB3蛋白水平与Akt磷酸化呈负相关，并且在胰岛素抵抗状态下，DNER表达和Akt激活下调，而TRB3表达上调。
为研究DNER调节肝糖异生的具体作用，一方面作者使用腺病毒干扰载体在AML-12细胞中敲低DNER蛋白，结果显示DNER表达的敲低减弱了Akt的磷酸化，从而降低了FoxO1的磷酸化水平，导致在基础和胰岛素刺激条件下糖异生基因（G6Pase和PEPCK）表达增加。DNER敲低过程中的这些变化伴随着2DG摄取减少、葡萄糖产量增加和GSK3a/b磷酸化减少。此外，DNER表达减少不影响TRB3基因表达，但增加了TRB3蛋白表达，表明DNER可能调节TRB3蛋白的稳定性。另一方面，作者将Ad-shDNER注射小鼠体内，以降低小鼠肝细胞中DNER的表达，葡萄糖和丙酮酸盐耐受性测试显示，敲低组小鼠葡萄糖耐受性显著受损，且丙酮酸-葡萄糖转化过度。与AML12肝细胞中的观察结果一致，体内DNER敲低同样伴随着TRB3蛋白表达的增加，Akt及其两个下游靶标GSK3a/b和FoxO1的磷酸化减弱，导致G6Pase和PEPCK的基因和蛋白水平增加。进一步研究发现，DNER对肝胰岛素信号传导的增强作用与Notch1和Girdin无关。
体内外敲低DNER降低胰岛素诱导的Akt-FoxO1-G6Pase/PEPCK信号通路的激活
2、DNER通过TRB3-Akt信号通路负调控肝糖异生
为了阐明DNER是否通过TRB3-Akt信号通路负调节肝糖异生，作者进行了蛋白质印迹分析。DNER的过表达显著增强了胰岛素刺激的Akt及其两个下游信号分子FoxO1和GSK3a/b的磷酸化，从而导致G6Pase和PEPCK的表达减少和葡萄糖产生减少；相反，DNER的敲低减弱了胰岛素刺激的Akt-FoxO1/GSK3a/b磷酸化，增加了G6Pase和PEPCK的表达，并促进了葡萄糖的产生。此外，DNER过表达或敲低诱导的肝脏糖异生中胰岛素信号通路的改善或受损可分别通过TRB3过表达或敲低得到挽救，这些结果表明，TRB3是DNER介导的Akt磷酸化和肝糖异生基因表达所必需的。
接下来，使用蛋白质印迹分析和qPCR研究了Akt在介导DNER对肝糖异生作用中的作用，发现DNER的过表达增强了胰岛素刺激的Akt激活和糖异生基因表达的抑制，使用wortmannin（Akt上游分子PI3K的抑制剂）处理，显著降低了DNER过表达对肝胰岛素信号传导的增强作用，相反，Akt磷酸化激活剂SC79则挽救了DNER敲低诱导的肝糖异生中受损的胰岛素信号传导。上述结果表明DNER通过TRB3-Akt依赖性途径负调控肝脏糖异生。
DNER对糖异生的抑制作用依赖于TRB3-Akt
3、DNER与胰岛素受体物理相互作用，并在Tyr677处磷酸化响应胰岛素刺激
为了研究DNER是否通过与胰岛素受体的物理相互作用增强胰岛素信号传导，作者进行了Co-IP实验，结果表明在基础和胰岛素刺激的条件下，DNER和胰岛素受体之间存在相互作用，胰岛素处理显著刺激DNER在酪氨酸的磷酸化，并且Tyr677是潜在的磷酸化位点。为了确定Tyr677磷酸化在DNER介导胰岛素增敏中的作用，作者在AML-12肝细胞中过表达HA标记的野生型和突变体（Tyr677-To-Ala）DNER。DNER突变和敲低都不影响TRB3的基因表达水平，进一步证实DNER在蛋白质水平而不是基因水平上调节TRB3。将DNER的Tyr677突变为Ala大大削弱了胰岛素刺激的DNER磷酸化，同时减弱了DNER诱导的TRB3降解，此外DNER对胰岛素刺激的Akt激活和糖异生基因（G6Pase和PEPCK）表达的抑制作用也显著降低，并伴随着FoxO1和GSK3a/b的磷酸化减少，2-DG摄取减少和葡萄糖产生增加。这些结果表明，Tyr677的磷酸化在糖异生中增强肝胰岛素信号传导起着关键作用。
Tyr677磷酸化是DNER促进胰岛素信号传导的必要条件
小结
本研究揭示了DNER在增强胰岛素刺激的Akt激活和抑制肝细胞糖异生中的新作用，证明了胰岛素刺激的DNER Tyr677磷酸化在诱导TRB3的蛋白酶体降解和通过Akt-FoxO1-G6Pase/PEPCK途径抑制肝糖异生中起着关键作用。胰岛素刺激Tyr677磷酸化的发现也揭示了DNER和胰岛素信号通路之间相互作用的机制。
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