IF 39.3｜李旭日/曹义海/赵晨研究团队揭示VEGF-B防止血管过度生成的潜在机制！
VEGF-B是VEGF-A的同源物，在血管内皮细胞(ECs)和许多其他细胞类型中高度表达。不同的研究报道了VEGF-B的各种作用，但其在血管系统中的具体作用仍不甚明了。2023年8月18日，中山大学中山眼科中心李旭日教授，瑞典卡罗林斯卡研究院曹义海教授联合复旦大学附属眼耳鼻喉科医院赵晨教授在“Signal Transduction and Targeted Therapy,IF 39.3”上发表了题为VEGF-B prevents excessive angiogenesis by inhibiting FGF2/FGFR1 pathway的研究论文。文章首次阐明VEGF-B结合FGFR1，诱导FGFR1/VEGFR1复合物的形成，从而抑制FGF2/FGFR1介导的Erk激活、血管生成以及肿瘤生长，揭示了VEGF-B作为抗血管生成因子的新功能。
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研究结果
1、VEGF-B与FGFR1特异性结合
作者利用人视网膜内皮细胞( HRECs )筛选了一个磷酸化受体酪氨酸激酶( pRTK )抗体阵列，发现VEGF-B可能与FGFR1相互作用；进一步检测发现VEGF-B与FGFR1特异性结合。接下来，作者研究了VEGF-B结合的FGFR1细胞外结构域，并生成了FGFR1不同细胞外结构域(D)的重组蛋白:FGFR1 DI、DII、DIII、DI-II和DII-III。利用过表达FGFR1的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞迁移实验验证这些重组蛋白的功能，发现FGFR1 DII-III减少了FGF2诱导的细胞迁移，而FGFR1 DIII没有。SPR分析和单结构域结合实验均显示VEGF-B与FGFR1 DIII和DII结合的KD值与FGF2相似，表明VEGF-B主要结合FGFR1结构域II和III。进一步研究发现VEGF-B与FGF2竞争FGFR1结合，并且VEGF-B可能通过竞争FGFR1结合来抑制FGF2的功能。
图1. VEGF-B与FGFR1结合，并与FGF2竞争FGFR1结合
2、VEGF-B诱导VEGFR1/FGFR1复合物形成
鉴于VEGF-B与VEGFR1和FGFR1结合，作者探讨了VEGF-B是否可以诱导VEGFR1/FGFR1复合物的形成。IP和WB结果显示，VEGFR1与FGFR1在小鼠脑、肺、心脏等组织中共免疫沉淀，证明存在天然的内源性VEGFR1/FGFR1复合物。重要的是，在小鼠眼睛玻璃体内注射VEGF-B会增加视网膜中VEGFR1/FGFR1复合物的数量，而用胎盘生长因子（PlGF）处理则没有。为了直接观察FGFR1/VEGFR1复合物，作者使用同时表达VEGFR1和FGFR1的HRECs进行了原位近距离连接实验，发现VEGF-B处理增加了FGFR1与VEGFR1的关联，而PlGF没有，表明VEGF-B的作用是特异性的。体内和体外实验表明，VEGF-B诱导FGFR1/VEGFR1复合物的形成。此外，VEGF-B以高亲和力结合VEGFR1/FGFR1异源二聚体。
图2. VEGF-B诱导VEGFR1/FGFR1复合物形成
3、VEGF-B抑制FGF2诱导的Erk活化
为研究VEGF-B诱导的下游信号，作者使用不同类型的内皮细胞筛选了磷酸化激酶抗体阵列，发现VEGF-B降低了人皮肤微血管内皮细胞1（HMEC1）、HRECs和HUVECs中的Erk磷酸化，验证发现VEGF-B的抑制作用是特异性的，VEGF-B对FGF2诱导的FGFR1激活的抑制作用在小鼠视网膜的体内也得到了证实。作者进一步用苯丙氨酸(F)分别代替FGFR1的六个酪氨酸(Y)，产生了一系列的定点突变。VEGF-B在表达野生型FGFR1 (WT-FGFR1)和FGFR1-F766, FGFR1-F654和FGFR1-F583突变体的细胞中抑制了FGF2诱导的Erk磷酸化，但在表达FGFR1-F463, FGFR1-F585和FGFR1-F653突变体的细胞中未发现该抑制作用，表明酪氨酸残基Y463, Y585和Y653对VEGF-B的抑制作用很重要。利用腺病毒（维真助力）在HUVECs中过表达野生型FGFR1和Y463F, Y585F和Y653F突变体，结果发现VEGF-B在过表达FGFR1 WT的HUVECs中增加了VEGFR1/FGFR1复合物的形成，但在过表达FGFR1 Y463F、FGFR1 Y585F或FGFR1 Y653F突变体的HUVECs中没有增加，表明酪氨酸残基Y463、Y585和Y653在介导VEGF-B诱导的VEGFR1/FGFR1复合物形成中的作用。以上体内外数据均表明VEGF-B对FGF诱导的Erk活化具有抑制作用。
图3. VEGF-B抑制FGF2诱导的Erk活化
4、VEGF-B抑制FGF2驱动的血管生成和肿瘤生长
接下来，作者探究了VEGF-B是否影响FGF2的血管生成活性。体内皮下Matrigel实验显示，VEGF-B抑制了FGF2诱导的血管生成，而PlGF则没有作用。利用表达高水平FGF2的小鼠T241纤维肉瘤细胞进一步验证了VEGF-B抗血管生成作用的体内相关性，发现T241-FGF2细胞在VEGF-B−/−小鼠中形成了更大的肿瘤，肿瘤血管生成增加。综上实验结果表明VEGF-B对FGF2介导的功能有抑制作用。进一步验证发现VEGFR1和FGFR1是VEGF-B发挥抑制作用所必需的。
图4. VEGF-B抑制FGF2驱动的血管生成和肿瘤生长
小结
本研究发现VEGF家族成员VEGF-B在高FGF2/FGFR1水平的条件下，通过抑制FGF2/FGFR1途径发挥抗血管生成因子的作用。在机制上，VEGF-B与FGFR1结合，诱导FGFR1/VEGFR1复合物形成，抑制FGF2诱导的Erk激活，从而抑制FGF2驱动的血管生成和肿瘤生长。本研究揭示了VEGF-B作为FGF2/FGFR1途径内源性抑制剂的新功能。
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