重组腺病毒的制备和使用

1. 重组腺病毒的制备

1.1 细胞转染（以转染 6孔板为例）

① 250μl DMEM和9μl PEI配成Mix1，静置5min以上。

② 250μl DMEM和1μg穿梭质粒、2μg包装质粒（即腺病毒骨架质粒），配成Mix2。

③ 将Mix1和Mix2混合，涡旋振荡混匀，瞬离后，静置30min以上，以便有充足的时间形成DNA-PEI复合物。

④ 静置期间铺6孔板HEK293细胞，细胞数约0.3-0.5×10⁶个/孔（也可提前铺板）。

⑤ 将静置后的混合液逐滴加入至6孔板细胞中。十字混匀后置于CO₂培养箱中培养。

1.2 扩增、收毒步骤

① 转染后约14天，将六孔板中有CPE的细胞连同培养基吹下加入至10cm dish，混匀后置于 CO₂培养箱中培养。

② 收集有CPE的10cm dish细胞，用电动移液器转移至 15mL离心管中，并做好相应的标记；

③ 3500rpm,离心7min；离心完成后，取出离心管，保留细胞沉淀，并将上清保存至其他离心管中备用。

④ 在细胞沉淀中加入腺病毒冻存液，用移液枪不断地吹打沉淀，保证完全回溶，吸到1.5mL EP管中。

⑤ -80℃及 37℃反复冻融四次。

⑥ 冻融完成后，12000g离心2min。

⑦ 将上清用1mL枪移到二维码管中，存放于-80℃的冰箱中。

1.3 大量扩增及收毒步骤

① 将收集起来的病毒上清平均滴加到10个10cm dish中，混匀后置于CO₂培养箱中培养，2-3天后收毒；

② 收集有CPE的10个10cm dish细胞，用电动移液器转移至50ml离心管中，并做好相应的标记；

③ 3500rpm,离心7min，分别收集上清和细胞沉淀；

④ 病毒上清加入PEG8000和NaCl，混匀后4℃直立放置过夜；细胞沉淀置于-80℃保存备用。

1.4 纯化前的处理

① 病毒上清处理

a. 第二天将4℃过夜的上清离心，3500g，4℃，离心 30min；

b. 离心后弃掉上清，收集病毒沉淀；

c. 用2mL冻存液将病毒沉淀重悬，收集到15ml管中备用。

② 细胞沉淀处理

a. 细胞沉淀用6mL腺病毒冻存液重悬，混匀，反复冻融四次；

b. 冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和沉淀（细胞碎片）；

c.上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用2mL冻存液进行重悬；

③ 超声波破碎细胞

a. 重悬后的细胞碎片超声波破碎3-4次，至液体不粘稠；

b. 超声完毕后，将液体分装到2个EP管中，12000g，4℃离心10min；

c. 离心完成后，与病毒上清和细胞沉淀处理后的样品混合。

1.5 纯化与浓缩

① 纯化——碘克沙醇密度梯度离心。

a. 配制不同浓度的碘克沙醇；

b. 取一个超离管，用电动移液器逐层、缓慢加入不同浓度的碘克沙醇；

c. 将处理好的病毒液加入到最上层；

d. 超速离心，48000rpm，2h30min。离心前应将对应的超离管配平，误差控制在0.1g以内。

② 浓缩

a. 离心完毕后，将超离管底用针头刺破，收集腺病毒所在层至15mL管中；

b. 将收集的病毒液用冻存缓冲液稀释至体积15mL，然后用0.2μm的滤膜过滤；

c. 将过滤后的液体置于一个15mL的超滤管中，3500g离心50min进行浓缩，一般离心2-3次后达到预定体积；

d. 将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，标明名称和日期。

e. 将收集起来的病毒涡旋震荡混匀后离心，吸10μL病毒液进行滴度检测。

1.6 病毒滴度检测

实时定量PCR法是一种简单的、高通量的测定病毒粗提裂解液和纯化病毒样本中腺病毒颗粒数量的方法。每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

① 去除游离DNA分子

先将病毒稀释10倍，以保证样品中游离的DNA充分降解：取5μl病毒至45μl PBS缓冲液中，充分混匀。按以下体系配制Mixture：

37℃ 孵育30 min，95℃加热5min使DNA酶失活。

② 去除病毒蛋白外壳

向上述体系中再加入 1μl蛋白酶K（5μg/μl）。37℃ 孵育30 min；再加30ul超纯水稀释至40ul（至此病毒原液稀释100倍），95℃加热5 min使蛋白酶K失活，然后12000rpm，离心2min，取上清进行qPCR检测。

③ qPCR 将步骤2得到的上清，取5μl进行10倍梯度稀释，即病毒原液稀释了1000倍。分别取2μl待测样品及标准品作为模板进行qPCR检测。

qPCR反应体系如下：

qPCR反应程序：

④ 数据分析

病毒颗粒数的计算：病毒颗粒数(VP/mL) =与标准品相对值×1000

2. 重组腺病毒的使用

2.1 腺病毒体外感染细胞

① 腺病毒感染目的细胞预实验

不同细胞系细胞表面的腺病毒受体数量不同，这就决定了不同细胞系所使用的MOI会有所不同。通常，易感染细胞系所使用的MOI范围为10-100。 但是，对于某些难感染的细胞系，MOI可能需要高达1000。对于大多数细胞系来说，最佳MOI的范围很窄。我们建议您查阅文献或者在正式实验前，在目的细胞中用报告基因的腺病毒进行预实验摸最佳MOI。

为了节省病毒，推荐使用96孔板进行预实验。操作步骤如下：

a. 第一天细胞的准备

将目的细胞接种于96孔板中，细胞融合率为50%较佳。为保证细胞生长良好，请保证细 胞贴壁过夜。

b. 第二天病毒的稀释

取 10μL腺病毒原液加入90μL培养液中做1:10稀释（10^-1），以此为起点做梯度稀释直至稀释10^-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。

c. 第二天感染目的细胞

取出提前准备好的96孔板，用准备好的病毒稀释液替代旧培养液，注意保留未加入病毒的 细胞孔作为对照组。

d. 第二至四天观察荧光或检测

腺病毒对细胞的感染较快，请在感染细胞后12、24、36、48小时分别观察细胞中荧光表达 情况（如果您选择的产品不带有荧光标签，请在 48、72、96、120小时分别收获细胞并通 过 Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达）。

② 腺病毒感染目的细胞实验

进行腺病毒感染实验时可使用完全培养液（培养目的细胞用）稀释。培养液中的血清、双抗或其他营养因子不会影响腺病毒的感染效率。 以 24孔培养板为例，进行HEK293细胞的感染实验操作步骤如下：

最适病毒用量的计算公式： 病毒用量pfu=最佳MOI×细胞数目/病毒滴度

例如,如果您目的细胞的最佳MOI=10，您需要感染10⁶的细胞，那么您共计需要107pfu的病毒.如果病毒滴度为1×10¹⁰ pfu/mL,那么您实验需要的病毒量就是1ul.

a. 第一天细胞的准备

在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3-5×10⁴个 HEK 293细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养液体积为300μL(进行病毒感染时细胞的汇合度约为70% )。

b. 第二天病毒的准备

根据实验的实际情况和MOI值，用培养液准确稀释腺病毒原液。 注意事项：可使用 PBS缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液。

c. 第二天感染目的细胞

在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液，混匀后放于CO₂培养箱（37℃、 5% CO₂）孵育过夜。

d. 第三天更换培养液 病毒感染细胞12小时后，更换培养液。

e. 第三天感染效率检测

感染 24小时后，可利用倒置荧光显微镜观察病毒感染目的细胞的效率。如选择的腺病毒载 体不带有荧光标记，可以通过Q-PCR(定量PCR)检测目的基因的表达来评估感染效率。

基因过表达

基因沉默

基因编辑