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蛋白磷酸化攻略大全

前几日，我们为大家介绍了关于反相蛋白微阵列RPPA的有关知识（『江湖召集令』癌症相关蛋白及磷酸化水平大数据等你来分析！），利用RPPA技术可以同时分析成百上千种细胞或者组织样本中不同蛋白的表达情况，包含修饰后蛋白（如磷酸化、甲基化、乙酰基化）的差异表达比对分析，那么，关于蛋白质翻译后修饰你了解多少呢，蛋白质磷酸化究竟又是怎么一回事？今天，小V就和大家一起来探索有关蛋白质磷酸化的那些事儿！

蛋白质翻译后修饰(PTMs)在生命体中具有十分重要的作用，它使蛋白质的结构更复杂，功能更完善，调节更精细，作用更专一。蛋白翻译后修饰包括：磷酸化、糖基化、甲基化、羟基化、脂酰化、羧基化等共价修饰。其中，蛋白磷酸化是非常常见和非常重要的翻译后修饰之一，它在每个生物的各个方面都扮演着重要的角色，例如基因转录、表达、细胞增殖、分化、凋亡、信号转导、免疫调控、肿瘤发生等。

一．蛋白磷酸化简介

蛋白磷酸化是在酶的催化作用下，将ATP γ位的磷酸基团，转移至蛋白质氨基酸侧链上的过程。该过程是可逆的，催化蛋白质发生磷酸化的酶被称为蛋白激酶（protein kinase, PK），而催化蛋白质去磷酸化的酶被称为蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PPase）（图1）。蛋白磷酸化是调节和控制蛋白质活性和功能的重要机制。

图1：蛋白质磷酸化和去磷酸化的过程（图片来源于网络）

二．蛋白磷酸化分类及位点

蛋白磷酸化是生物体内普遍存在的一种调节方式。据报道，人类基因组编码的21000个蛋白质中，90%以上发生了磷酸化。根据被磷酸化的氨基酸残基不同，蛋白质磷酸化可分为 4 大类，具体分类和磷酸化位点见表1，磷酸化的9个氨基酸分子式见图2。超过三分之一的蛋白磷酸化发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上：其中丝氨酸残基最多（86.4%），其次是苏氨酸残基（11.8%），酪氨酸残基最少（1.8%）。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化组成了O-磷酸化。O-磷酸化在酸性条件下非常稳定，因此在细胞生物学和磷酸化蛋白质组学中研究广泛。而N-磷酸化由于不稳定导致其检测极具挑战性。加之，催化N-磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的缺乏进一步限制了它的研究。其他两类磷酸化（S-磷酸化和酰基磷酸化）的研究报道却少之又少。

表1：蛋白磷酸化类型及位点

图2：磷酸化的9个氨基酸分子式

（B. Huang et al. International Journal of Biological Macromolecules 145 .2020）

三．蛋白磷酸化相关酶

人类基因组中约有500多种激酶和200多种磷酸酶能调控蛋白的磷酸化过程，这使得蛋白磷酸化更为复杂，这些磷酸化相关酶在精细调控生物体的众多细胞过程中可发挥关键作用。

1、蛋白激酶
蛋白激酶属于激酶大家族，是一类磷酸转移酶，负责将ATP γ位的磷酸基团转移至底物蛋白质的特定氨基酸，从而使蛋白质磷酸化，进而发挥生理生化功能。在人类基因组中，大约2%的人源基因编码518个蛋白激酶。根据其磷酸化的氨基酸残基不同，蛋白激酶可以分为五大类：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、组氨酸/赖氨酸/精氨酸蛋白激酶、半胱氨酸蛋白激酶和天冬氨酸/谷氨酸蛋白激酶。
2、蛋白磷酸酶
蛋白磷酸酶的功能跟蛋白激酶的功能相反，负责磷酸化蛋白的去磷酸化。目前，大约有226种已知的蛋白磷酸酶。蛋白磷酸酶分为3个家族：磷酸蛋白磷酸酶家族、金属依赖性蛋白磷酸酶家族和蛋白酪氨酸磷酸酶家族。

四．蛋白磷酸化的检测方法

蛋白质磷酸化的分析和磷酸化位点的鉴定已成为目前蛋白质组学研究的关注点之一。目前蛋白质磷酸化的检测方法主要有特异性抗体（如western blot）、p32放射性标记、质谱、化学生物相结合、核磁共振等。每种方法有其各自的优缺点（表2），研究人员可根据实验设计挑选合适的检测方法。

表2：蛋白质磷酸化检测方法的比较
（B. Huang et al. International Journal of Biological Macromolecules 145 .2020）

五．定点突变在蛋白磷酸化研究中的作用

定点突变可以随心所欲地改变已知DNA序列中的碱基。在基础研究中，科研工作者通常需要通过改变DNA序列获得突变基因，以研究基因结构与功能之间的关系；或者通过改变氨基酸序列获得突变蛋白，以研究蛋白质结构和功能的关系，从微观水平阐明生理状态下基因的调控机理、疾病的病因和发病机制。在磷酸化蛋白的研究中，构建模拟磷酸化和非磷酸化的突变实验是研究磷酸化功能效应的一种常用方法。
1. 磷酸化位点的查找
磷酸化定点突变实验的第一步首先要查找磷酸化位点。我们以常用的蛋白数据库UniProt为例说明，具体步骤如下：
（1）通过https://www.uniprot.org/链接进入UniProt官网，进入如下主界面：

（2）以人源p53蛋白为例，在Search栏（见上图红色标记位置）中输入p53，进入如下界面：

（3）点击人源p53蛋白在数据库中的编号“Q04637”（上图红色箭头所示），查看专家注释。这里重点介绍“PTM/Processing”。点击下图左边红色箭头指向的“PTM/Processing”栏查看分子加工、氨基酸修饰、翻译后修饰、蛋白组学数据库、翻译后修饰数据库和参考文献。

（4）假如我们对15位的磷酸化位点修饰，点击红色圈中的15即可查看对应的氨基酸序列（见下图，黄色标记的“S”）。

（5）接下来，我们返回上一页面，点击数据库中的“Names & Taxonomy”选项查找该基因的mRNA序列，点击蓝色标记的基因名即可查阅该基因的详细信息。

（6）p53的mRNA序列查找可点击黄色箭头处获取：

2. 表征磷酸化修饰的定点突变
1）表征磷酸化修饰的突变氨基酸
通过第2部分磷酸化类型的介绍，我们知道Ser、Thr和Tyr残基上的磷酸化较常见，特别是Ser。根据文献报道，表征这3种磷酸化修饰的定点突变见表3：

表3：表征Ser、Thr和Tyr磷酸化修饰的突变氨基酸

2）表征磷酸化修饰的原理
蛋白质的磷酸化导致磷酸基团受体氨基酸残基上增加了净负电荷（pSer，pThr和pTyr带2个负电荷【见上述图2】）。而取代的酸性氨基酸（Glu和Asp）的负电荷侧链在一定程度上模拟了蛋白质中磷酸基团的添加，且长度相似。为了使得实验结果准确，除了构建模拟磷酸化的突变体外，模拟非磷酸化的点突变构建也是必需的，即磷酸基团受体氨基酸残基被一个不带电的和不能磷酸化的氨基酸残基所取代。目前，Ala和Phe已成功模拟非磷酸化。
3）如何选择表征磷酸化修饰的突变氨基酸？
表征磷酸化修饰的突变氨基酸选择主要从氨基酸的长度、大小、电荷和结构方面选择。例如，与磷酸化的氨基酸残基相比，Glu或Asp除了带1个负电荷外，还可能占据更小或不同的空间。因此，在许多情况下，Glu可能比更小的Ala能更好地模拟pSer。但是，注意不是所有情况，这2种氨基酸均已成功模拟pSer。再比如，对于非磷酸化的模拟，Ala经常被作为取代的氨基酸残基。但是，对于非磷酸化的Tyr，Phe可能是一个更好的的选择。

六．应用实例

实例一蛋白磷酸化与肝自噬
2018年10月，浙江大学医学院刘教授课题组在Molecular Cell(IF=15.584)杂志发表了题为“mTORC1-Regulated and HUWE1-Mediated WIPI2 Degradation Controls Autophagy Flux”研究论文，该论文从采用质谱确定WIPI2新的互作蛋白出发，经体内外实验发现mTORC1 & WIPI2 &HUWE1三者之间的调控关系、功能效应、生物效应和生理功能：WIPI2是mTORC1新的磷酸化底物。mTORC1通过磷酸化WIPI2，促进WIPI2与其E3泛素连接酶HUWE1的相互作用，导致WIPI2的泛素化和经蛋白酶体的降解，最终抑制自噬，调控模型示意图见图3。

图3：mTORC1 & WIPI2 &HUWE1在细胞自噬中的调控示意图

在这里，我们重点展示作者体内生理功能的科研成果，这部分研究涉及到模拟磷酸化和非磷酸化突变体的构建，而且非常荣幸的是，本部分研究所用AAV产品由维真生物助力。首先，作者饥饿处理小鼠12h&24h，通过Western Blot发现肝脏中的WIPI2蛋白量增加，而磷酸化的WIPI2却减少。为了获得WIPI2磷酸化调控小鼠肝自噬的直接证据，作者使用rAAV-WIPI2, rAAV-WIPI2-S395A, or rAAV-WIPI2-S395D腹腔注射小鼠，4周后发现WIPI2-S395A蛋白量增加，而WIPI2-S395D却减少；而且，与WT-WIPI2相比，WIPI2-S395A而不是WIPI2-S395D明显降低了P62和NBR1的蛋白量。此外，腹腔注射rAAV-shHUWE1的小鼠LC3 puncta、WIPI2的蛋白量和P62&NRB1的降解均表现出了增加（图4）。

图4：mTORC1介导的WIPI2磷酸化在小鼠肝脏中调控细胞自噬

实验参数

实例二蛋白磷酸化与细胞迁移、增值和分化
几乎在同一时间，香港浸会大学的张老师课题组在Cell Death Discov(IF=4.114)杂志发表了题为“Oleanolic acid enhances neural stem cell migration, proliferation, and differentiation in vitro by inhibiting GSK3βactivity”研究论文，揭示了齐墩果酸(OA)通过抑制GSK3β活性促进神经干细胞的迁移、增殖和分化，此项工作成果对于治疗神经退行性疾病具有重要的意义。

首先，作者通过神经球形成实验证明OA增加NSCs的迁移；通过CCK-8实验和神经球形成实验证实了OA促进NSCs的增殖；通过western blot和免疫荧光实验揭示了OA促进NSCs分化为神经元。接着，作者通过分子对接表明GSK3β是OA作用的直接靶基因。最后，作者通过western blot和构建非磷酸化突变体（维真生物助力腺病毒）揭示了本论文主题，实验结果见图5。

图5：齐墩果酸(OA)通过抑制GSK3β活性促进神经干细胞的增殖和分化

[注：Nestin (NSCs marker)；MAP2 (microtubule-associated protein-2, neuron marker)；GFAP(astrocytes marker)]

实验参数

维真生物助力蛋白质磷酸化研究

维真生物已建成了18000余种人源基因的现货克隆库与12000余种人源基因的腺病毒库，并有蛋白激酶与磷酸酶的克隆子库，可为您提供蛋白质磷酸化相关基因的克隆与腺病毒；我们还建成了靶向13000余种小鼠基因的gRNA pool 克隆库，同样地，我们也有蛋白磷酸化相关基因的gRNA pool克隆子库，您可直接包装AAV，搭配spCas9的转基因小鼠，完成基因在体内的精准调控，所以如果您有基因丧失方向的实验需求，这款产品将是您的理想选择！此外，我们还有靶向700余种人源激酶的gRNA慢病毒文库，配合CAS9慢病毒或CAS9稳定细胞系，可实现快速高通量地筛选。不仅如此，我们还可以根据您的实验需求进行磷酸化相关基因的定点突变，并为您提供下游的病毒包装和基因检测服务等。
部分产品与服务如下：
1、人源蛋白激酶与磷酸酶的现货克隆子库
2、鼠源蛋白激酶与磷酸酶的gRNA pool现货克隆子库
3、人源蛋白激酶的gRNA慢病毒文库
4、人源蛋白激酶与磷酸酶的现货腺病毒
5、蛋白磷酸化相关基因定点突变、干扰和敲除
6、蛋白磷酸化相关基因慢病毒、腺病毒、AAV包装
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