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AAV在肝脏研究中的靶向策略(干货篇)

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肝脏是较早被用于基因治疗的器官,现已明确许多肝病是由单基因缺陷引起,因此相比其他由多基因缺陷引起的复杂疾病更适合开展临床基因治疗。肝靶向基因治疗面临的挑战在于肝细胞的有效靶向、载体基因组的稳定性和持续的高水平表达,rAAV载体的出现及使用使这一难题的解决成为可能。今天小V就带大家一起学习一下rAAV在肝脏应用中的相关选择策略。

Vol.1

AAV血清型的选择


在肝脏中应用较多的有AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及AAV-DJ等血清型,研究表明AAV8、AAV9和AAV-DJ对肝脏均具有较强的亲嗜性,其中AAV8嗜肝性更强,用于活体动物注射表现为免疫原性低,感染效率高,AAV-DJ的体内肝细胞转导效率与AAV8相近,且在体外实验中也能表现出较强的感染效率。

研究者还可根据实验目的及动物模型的不同选择不同的血清型,其中AAV7、AAV8对小鼠肝脏感染具有较好效果;而在人体肝脏中AAV2、AAV5和AAV8亲和性较强。

如下图所示:无论是选用门静脉还是尾静脉注射,AAV8均能有较高的肝脏转导水平


AAV8对肝脏的高转导效率(TV&PV)
我们根据感染种类的不同对推荐的血清型做了一个汇总供大家参考:
种类 AAV血清型推荐
小鼠肝脏 AAV7、AAV8
高等灵长类动物肝脏 AAV2、AAV5、AAV8



Vol.2

启动子的选择



在肝脏中,广谱型启动子CMV即可高效表达,也可以选择肝脏特异启动子增强组织靶向性,如ALB、TBG和ApoEHCR-hAAT,其中TBG应用较多

启动子 启动子 大小
广谱启动子 CMV(常用) 600bp
CAG 944bp
特异性启动子 ALB(较大) 2.4Kb
TBG(常用) 460bp
ApoEHCR-hAAT 1.3Kb


与CMV相比,TBG启动子的肝脏特异性更强
(A) Mice received AAV9.CMV.EGFP.T2A.Luc. (B) Mice were injected with AAV9.TBG.EGFP.T2A.Luc.
(Chen SJ et al . Hum Gene Ther Methods. 2013)




Vol.3

常用的肝脏注射方式



肝脏对全身应用AAV有较高的亲合性,AAV在肝脏中的注射方式分为直接传送和外周传送两种(下表所示),其中尾静脉注射和腹腔注射是目前应用比较广泛的注射方式,操作者也可根据实验目的选择合适的注射方式。

注射方式 覆盖 优点 缺点
直接传送 肝叶注射、门静脉注射、脾包膜注射;肝动脉注射(大动物与人); 克服了转导效率低的问题,靶向性高,所需病毒量少; 侵入性强,风险大,实验操作技能要求高;
外周传送 腹腔注射和静脉注射(尾静脉注射和眶后静脉窦注射等); 操作简单,无须手术或麻醉; 靶向性较直接传送稍差,可能需要较多的注射体积;


图一:小鼠肝脏中AAV给药途径示意图
(Palaschak, B., R.W. Herzog and D.M. Markusic, Methods Mol Biol, 2019.)
(A)小鼠侧视图,显示侧尾静脉或眶静脉窦注射路线;(B)小鼠仰卧位图,显示非手术腹膜内和手术肝内、脾内和门静脉输送路径。



图二:推荐的AAV肝脏注射方式和血清型种间比较
(Palaschak, B., R.W. Herzog and D.M. Markusic, Methods Mol Biol, 2019.)


在此,我们介绍一下几种常用的注射方式,肝门静脉注射、肝实质内注射、尾静脉注射以及新生小鼠静脉注射的操作步骤供大家参考。



1. 肝门静脉注射



1)通过腹腔注射麻醉剂将成年小鼠麻醉,对小鼠腹部局部区域做去毛及消毒处理;

2)距剑突软骨下方2-3mm处,做一个2-3cm的中线切口。

3)暴露门静脉,使用30G针头在1min内均匀缓慢注射0.2 ml病毒悬液

注:门静脉是一种相对较大的静脉,提起肝前叶一般即可看到门静脉。在手术过程中,用浸泡在生理盐水中的无菌纱布覆盖肠道,保持肠道湿润。

(4)注射后保持针位约10-20秒。取出针后,做好防出血处理;

(5)缝合腹部,将小鼠放置于加热灯下,直至恢复意识。然后将其放回笼子单独饲养,直到伤口完全愈合。


2. 肝内注射



1)通过腹腔注射麻醉剂将成年小鼠麻醉,对小鼠腹部局部区域做去毛及消毒处理;

2)在距剑突软骨下方2-3mm,做一个2-3cm的中线切口,以露出肝脏。

3)用固定在结核菌素注射器上的30G针头将病毒悬液缓慢注入肝实质中。

:在注射过程中通过手术立体镜监测注射部位,确保无出血或外渗。如果出现上述任何一种情况,需取出针头,轻轻按压止血,然后选择一个新的部位进行注射。

(4)取出针,用无菌纱布轻轻按压止血。

(5)再选择其他部位进行注射。

:一只成年小鼠一次可选择4 ~ 5个不同的注射位点(40 ~ 50μl/site),总剂量可达200μl。

(6)缝合腹部,将小鼠放置于加热灯下,直至恢复意识。然后将其放回笼子单独饲养,直到伤口完全愈合。


3. 尾静脉注射



(1)将小鼠放在标准限制器中,使注射器能够完全接触到整个尾巴长度。

2)将一根30G的针头固定在1cc结核菌素注射器上,尽可能远的插入尾部侧面静脉。选择一个远端部位,如果第一次注射失败,可以选择另一个更近端的注射部位。

注:a:小鼠尾巴上较容易接触到的静脉位于尾巴的侧面,且侧静脉非常浅无需进针很深;小鼠尾部背面的静脉很难常规注射;尾部腹面的血管是动脉,不可注射。

b:注射前用温水轻轻地加热尾巴,可以使血管得到一定程度的舒张,便于注射。

(3)针头到位后,缓慢注射病毒悬液。

: 如果注射器由于压力增加而难以压下柱塞,此时很可能针头不在静脉中。在这种情况下,应取下针头并选择一个新的位置重新注射。

(4)注射完成后取下针头,轻轻按压止血,然后立即将小鼠放回笼中。

注:使用此方法注射成年小鼠,病毒用量控制在300 - 400μl较佳。


4. 新生小鼠静脉注射



(1)需两个人配合完成,一人固定,一人注射;

(2)注射前将小鼠置于干毛巾上,减少活动及损伤;

(3)一人轻轻固定小鼠,使侧面朝上暴露眼睛至颈部的颞浅静脉,置于放大镜下;

(4)另一人沿着自头至颈的方向将30G的注射针头插入静脉旁的皮下,慢慢推进静脉(新生鼠皮肤呈现半透明,较易观察)

(5)慢慢注射病毒悬液;(如果注射成功,注射部位远端静脉会呈白色,如果未成功,皮下注射10μl即可看到明显的隆起)

(6)注射完成后,取下针头,轻轻按压静脉,通常2-3分钟会停止出血;

(7)将新生鼠在加热灯下照射后,放回母鼠身边;

(8)如果注射不成功,让小鼠恢复5-10分钟,然后在另一侧尝试第二次注射;

注:使用此方法注射新生小鼠,病毒用量控制在100μl以内较佳。





Vol.4

总结


在应用AAV进行肝脏研究时,可以选择靶向性更强的肝门静脉注射肝实质内注射方式,如果实验技能受限或减少侵入性损伤,也可以选择尾静脉注射等实验技能要求稍低的给药策略,在这种情况下,就可以配合AAV8等肝脏嗜性较强的血清型以及TBG等肝脏特异性启动子提高AAV对肝脏的感染效率,以达到理想的实验效果。



Vol.5

参考文献


1. Markusic D M , Hoffman B E ,Perrin G Q , et al. Effective gene therapy for haemophilic mice with pathogenic factor IX antibodies[J]. Embo Molecular Medicine, 2013, 5(11):1698-1709.

2、Optimized human factor IX expression cassettes for hepatic-directed gene therapy of hemophilia B[J]. Frontiers of Medicine, 2015, 9(1).

3、Chen Ling, Yuan, et al. High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors[J]. Journal of Visualized Experiments, 2011(49):e2538-e2538.

4、Xu L , Daly T ,Gao C ,et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.[J]. Human Gene Therapy, 2001, 12(5):563.

5、Cai S R,Garbow J R,Culverhouse R,et al.A mouse model for developing treatment for secondary liver tumors[J].International Journal of Oncology, 2005,27(1):113-120.

6、SFERRA, T.Widespread Correction of Lysosomal Storage Following Intrahepatic Injection of a Recombinant Adeno-associated Virus in the Adult MPS VII Mouse[J].Molecular Therapy the Journal of the American Society of Gene Therapy,2004,10(3):478-491.

7、Sands M S .AAV-mediated liver-directed gene therapy.[J].Methods Mol Biol, 2011, 807:141-157.

AAV在肝脏研究中的靶向策略【应用篇】(可点击查看)



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