稀疏标记技术—实现对单个神经元的重构

顾名思义，单细胞标记/稀疏标记技术就是对单个神经元进行明亮标记，从而实现在单神经元水平上解析大脑结构，绘制单神经元投射图谱。

2. 为什么要对单个神经元进行标记？

以往的研究主要注重于描绘大脑中的不同脑区之间以及不同位置神经元类群之间的连接，虽然这些脑连接图谱揭示了神经系统的基本结构，但由于缺乏单细胞精度，脑区水平或神经元类群水平的连接图谱并不能准确反映神经系统的精细结构，因此阐明单个神经元的轴突和树突投射模式已经成为探索大脑神经回路结构的关键，重建单个神经元不仅能帮助我们了解其在神经环路中的形态结构，还有助于精确解析有关神经信号如何组织及如何通过大脑传递到目标区域。

双AAV载体稀疏标记系统是由北京生命科学研究所罗敏敏教授团队和华中科技大学龚辉教授团队合力开发的，这一基于腺相关病毒（AAV）载体的标记方法能够以细胞类型和投射特异性对单个神经元进行强烈和稀疏标记。利用此系统，研究团队实现了单神经元在全脑水平的完整重构，以及透明化脑片中间神经元的形态重构。这一技术的开发扩展了人们在单神经元水平上解析大脑结构的能力，并有助于在正常和病理条件下绘制单神经元投射图谱。

①双AAV载体稀疏标记系统的设计原理
超新星（Supernova）载体通过tTA/TRE正反馈表达机制的泄露表达来稀疏和明亮地标记神经元，但缺乏细胞类型特异性，研究者在此基础上进行改造，将一对正交重组酶（Cre/Flp）与tTA/TRE正反馈表达机制相结合。
改进的稀疏标记系统由两个AAV载体组成：①控制子（controller）：包含一个TRE启动子和一个编码Flp重组酶 (FLPo，其中“o”表示优化的版本)的Cre依赖的表达盒；②放大子（amplifier）：也使用TRE启动子，但带有一个编码绿色荧光蛋白GFP和Tet转录激活因子tTA的Flp依赖的表达盒（图1）。

图1、双AAV载体稀疏标记系统的设计原理

（Lin R., et al.,  Nat Methods, 2018.）

②双AAV载体稀疏标记系统的工作原理
将两种AAV载体混合后注射到表达Cre的小鼠脑区，当病毒感染Cre阳性神经元后，控制子中Cre依赖的转录元件会被翻转。但由于此时神经元细胞中没有表达tTA，TRE启动子转录活性极低，无法驱动FLPo的强烈表达，也就不能触发放大子中Flp依赖的转录元件的翻转。由于TRE启动子低水平的渗漏表达，极少数Cre阳性神经元中FLPo的表达量达到一定的水平，进而能触发放大子载体上Flp依赖的转录元件的翻转，从而表达微量的GFP和tTA。此时，仅极少数细胞内tTA的表达量达到一定水平，触发了放大子中Flp依赖的转录元件的翻转。然后tTA水平足以与TRE启动子结合，激活控制子和放大子载体上的转录元件表达，由此启动了一个正反馈循环，进一步提高了GFP的表达水平，标记强度得到增强（图2）。

图2、双AAV载体稀疏标记系统的工作原理

（Lin R., et al.,  Nat Methods, 2018.）

③双AAV载体稀疏标记系统的优势
1）由于标记的触发依赖于Cre，通过将该稀疏标记系统与Cre转基因小鼠联用，可有效对大脑特定区域的特定类型的单个神经元进行稀疏、明亮地标记；
2）通过调整控制子和放大子的混合比例，能够控制标记的稀疏程度；
3）通过结合多种位点特异性重组酶可以建立更多版本，有望实现更复杂的表达策略；
4）理论上，该系统可以与光遗传学、分子探针和基因编辑等元件联用，用于单细胞水平功能性研究；
总而言之，双AAV稀疏标记系统这一技术的开发将有助于将脑连接谱研究推向单细胞精度，并有希望帮助研究人员在单细胞精度下对正常及病理状态的神经元进行研究。

④双AAV载体稀疏标记系统的应用
借助双AAV稀疏标记系统，研究者不仅可对中脑多巴胺神经元进行特异性标记，而且还可对单个神经元的特异性投射进行有效标记；此外，将该标记系统与荧光显微光学切片断层成像系统（fMOST）相结合，可建立一个包括细胞类型特异性稀疏标记、高分辨率全脑成像、形态学重建和定量分析的通道，在全脑水平上实现了进行定量单神经元重建的可能性。最后，将该稀疏标记系统与组织透明技术uDISCO结合使用，实现了对中间神经元的快速重构，并且可以高效地对神经元树突的分支特征进行量化分析。详情可下载原文进行查看：https://doi.org/10.1038/s41592-018-0184-y

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参考文献：

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