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Bioactive Materials ‖湖南大学胡小晓团队揭示核酸适体S11e特异性识别纤维肉瘤并抑制肿瘤生长的机制

湖南大学胡小晓团队与3保1 shRNA慢病毒

近日,湖南大学胡小晓副教授团队在综合性国际学术期刊《Bioactive Materials》上发表了“DNA aptamer S11e recognizes fibrosarcoma and acts as a tumor suppressor”的研究论文,该团队筛选出了一条能特异性识别纤维肉瘤的核酸适体,确定了其目标功能靶点Diablo/SMAC,并初步揭示了核酸适体S11e促进纤维肉瘤凋亡机制并抑制其迁移和侵袭。

维真生物慢病毒产品为本研究助力!

基因信息 人源Diablo/SMAC基因(促凋亡作用)
病毒产品 Diablo/SMAC 3保1 shRNA 慢病毒
细胞类型 人纤维肉瘤细胞HT1080
用法 病毒感染24h后puro筛选稳转株
MOI MOI : 1 MOI : 4

研究背景


纤维肉瘤是一种侵袭性强、复发率高、预后差的恶性肿瘤,可以发生在任何年龄、人体纤维组织的每一个部位。目前,手术切除是纤维肉瘤的主要治疗方法,但由于缺乏特异性的生物标记物,无法准确诊断纤维肉瘤可能导致不理想的切除手术结果,并降低生存率。因此,为了潜在地解决这一临床需求,探究分子探针用于早期诊断和靶向治疗和纤维肉瘤准确的预测至关重要。

研究思路


在本研究中,作者发现核酸适体S11e能够识别纤维肉瘤细胞(HT1080),并且S11e能在HT1080异种移植小鼠模型和纤维肉瘤患者的肿瘤组织中识别肿瘤。此外,作者还证实了S11e不依赖于溶酶体途径而内化到HT1080细胞中,并位于线粒体中。不仅如此,还发现S11e促进了HT1080细胞的凋亡,并抑制了HT1080细胞的迁移。最后,作者利用质谱方法研究了S11e的生物功能细胞靶点,发现Diablo/ SMAC蛋白是S11e的细胞结合蛋白,通过与S11e相互作用抑制HT1080细胞的迁移和侵袭。综上所述,这些结果表明S11e可能有助于纤维肉瘤的早期诊断、靶向治疗和预后。

部分研究成果分享


1. S11e在HT1080细胞中的细胞器共定位

首先,作者利用流式细胞术检测HT1080与已有的具有已知序列的核酸适体的结合能力,成功的鉴定到与HT1080有高亲和力的S11e。接着,分析探讨了S11e在HT1080细胞中的细胞器共定位,发现溶酶体追踪器和cy5标记的S11e的荧光信号没有重叠,线粒体荧光探针Mito-tracker和cy5标记的S11e荧光信号在4℃完全重叠,表明S11e可以定位于HT1080细胞的线粒体。此外,S11e可以在不被溶酶体内化的情况下成功逃逸到线粒体中,使S11e成为一种极好的潜在载体,可以保护自己免受溶酶体中各种消化酶的降解。

图1.HT1080细胞与Cy5-S11e(红色)和Mito-tracker及Lyso-track(绿色)的共定位

2. S11e特异性识别肿瘤组织

核酸适体识别体内肿瘤的能力是评价能否应用于临床的重要指标。为此作者将修饰后的核酸适体通过尾静脉注射小鼠,发现注射后5min,S11e在肿瘤部位的荧光信号增强,而Library在肿瘤部位未见明显荧光信号,说明S11e在肿瘤部位聚集。通过观察Cy5标记的S11e在小鼠体内的生物学分布,发现S11e在体内具有靶向纤维肉瘤的能力。

图2. S11e在HT1080异种移植小鼠模型中的荧光成像

作者进一步通过将Cy5和Cy5标记S11e与纤维组织病理切片共同孵育,发现正常组织中未见红色Cy5荧光信号,良性肿瘤组织中可见轻微红色荧光信号,恶性肿瘤组织中可见强红色荧光信号,表明S11e在体外可以识别纤维肉瘤组织。

图3.S11e识别患者组织样本中的肿瘤细胞

3. S11e促进纤维肉瘤细胞凋亡并引起相关蛋白表达的改变

为研究S11e的生物学功能,作者进行了细胞毒性实验。分别用S11e和Library(随机文库)处理HT1080细胞后,细胞活力分别为49.08%和93.42%,说明S11e而不是Library对HT1080细胞具有细胞毒性作用。综上所述,S11e可有效诱导HT1080细胞凋亡,提示S11e对肿瘤细胞具有潜在的治疗作用。

图4. S11e或Library对HT1080和MRC-5细胞毒性分析

接下来,作者利用Western blotting实验对S11e诱导HT1080细胞凋亡的途径进行了进一步探究。发现HT1080细胞与S11e孵育后,cleaved- caspase -9 (37 kDa)、cleaved- caspase -3 (17 kDa)和cleaved- PARP (89 kDa)的表达增加。当Caspase-9被激活时,Caspase-3被激活,Caspase-3进一步切割凋亡的关键酶PARP,直接诱导凋亡。这些结果表明,S11e特异性地通过线粒体介导的内源性凋亡途径诱导细胞凋亡。

图5. S11e或Library 处理后,HT1080细胞中凋亡蛋白的表达

4. Diablo/SMAC是S11e结合的功能性细胞蛋白

接下来,作者探究了与S11e结合的功能性细胞蛋白。有趣的是,在S11e处理的细胞中特异检测到分子量为85 kDa和20 kDa的两条蛋白带,而在Library处理的细胞中检测不到。通过重点筛选分子量在15-25 kDa至70-90 kDa之间的蛋白,然后用S11e与Library的评分比对其进行排序,发现Diablo/SMAC (21 kDa)在凋亡触发后可以从线粒体膜间隙释放到细胞溶胶,与其他攻击相比排名较高。因此,作者推测Diablo/SMAC是S11e的潜在结合靶点。

图6.S11e结合蛋白质谱分析

为证实上述推测,作者使用三条独立的Diablo/SMAC特异性shRNA进行了功能缺失分析,其中shSMAC 1和shSMAC 2对Diablo/SMAC干扰效果更加显著。

图7.Diablo/SMAC shRNA敲除效果

作者还对经S11e处理的Diablo/SMAC沉默的HT1080细胞进行了细胞划痕和侵袭实验。结果表明,SMAC的表达降低后,S11e对HT1080细胞迁移和侵袭的抑制作用被消除,上述结果证实,SMAC是纤维肉瘤细胞中S11e的功能性结合靶点。

图8.Diablo/SMAC为S11e的功能结合蛋白

小结


综上所述,本研究发现核酸适体S11e可以特异性识别纤维肉瘤细胞,并且S11e能在HT1080异种移植小鼠模型和纤维肉瘤患者的肿瘤组织中识别肿瘤组织;同时发现S11e可以促进HT1080细胞的凋亡并抑制了HT1080细胞的迁移。此外,确定了Diablo/ SMAC蛋白是S11e的细胞结合蛋白,通过与S11e相互作用抑制HT1080细胞的迁移和侵袭。

本研究为S11e作为纤维肉瘤的早期诊断、靶向治疗和预后的有效工具提供了新的见解。

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